Identification and initial characterization of antibacterial agents secreted by bacteria of the genus Bacillus isolated from wild birds

Problem szybkiego rozprzestrzeniania się antybiotykooporności wśród drobnoustrojów chorobotwórczych ma globalny charakter. Badania mikroorganizmów, a także produktów ich metabolizmu jest uzasadnione, a opracowanie nowych metod wyszukiwania związków bakteriobójczych wśród produktów metabolizmu drobnoustrojów staje się jeszcze bardziej istotne. Zachęcającym kierunkiem w projektowaniu i ulepszaniu antybiotyków peptydowych albo bakteriocyn jest wykorzystanie bakterii z rodzaju Bacillus.Bakterie z gatunku Bacillus licheniformis oraz Bacillus pumilus są aktualnie badane pod kątem wytwarzania peptydów podobnych do bakteriocyn, które wykazały szerokie spektrum działania antagonistycznego przeciwko różnym gatunkom bakterii Gram-dodatnich w tym MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) i VRE (vancomycin-resistant Enterococcus faecalis).Mając niepowtarzalną okazję żeby sprawdzić i scharakteryzować właściwości czynników antybakteryjnych otrzymanych szczepów (w ramach realizacji projektu studenckiego realizowanego w ramach Studenckich Minigrantów Badawczych POB BioS Uniwersytetu Jagiellońskiego 2020/2021), za pomocą relatywnie prostych testów mikrobiologicznych zdecydowano podjąć próbę zbadania izolatów z rodzaju Bacillus w celu poszukiwania producentów związków przeciwbakteryjnych oraz dalszej jej charakterystyki.Aktywność bakteriobójczą uzyskano wobec szczepów referencyjnych Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6633 i Micrococcus luteus ATCC 4698. Badane związki z bakterii rodzaju Bacillus są bardzo wraźliwe i muszą być dobrane odpowiednie warunki do hodowli oraz izolacji tych czynników dla dalszych analiz. Nie wykazano aktywności antybakteryjnej dla Escherichia coli. Bakterie patogenne Gram-ujemne są dużym problemem, gdyż jest mało leków stosowanych w terapii zakażeń. Znależenia takiej alternatywy byłoby bardzo ciekawym podejściem do zwalczenia takich groźnych bakterii.Należałoby skupić uwagę na szczepie 212 (Bacillus pumilus) i przeprowadzić szereg badań dla pełnej charakterystyki związków produkowanych przez ten mikroorganizm, które potencjalnie mogą być bakteriocynami, ze względu na wykazującą aktywność bakteriobójczą wobec Staphylococcus aureus.W dalszych badaniach aktywność bakteriobójczą należałoby wyrazić w jednostkach arbitralnych (AU), zdefiniowane jako maksymalne rozcieńczenie, które wytworzyło minimalną strefę, która nadal dawała wyraźnie widoczną strefę antagonistyczną, przeprowadzić testy MIC, zbadać wrażliwość peptydów bakteriocynopodobnych wobec enzymów proteolitycznych, stabilności termicznej, pH oraz wpływu chemikaliów. Ponadto należy podjąć próbę oczyszczania związku w oparciu o metody wykosprawnej chromatografii cieczowejoraz zbadać aktywność antagonistyczną wobec szerszej gamy mikroorganizmów referencyjnych.

It is becoming increasingly difficult to ignore the rapid spreading of antibiotic resistance among pathogenic microorganisms. Researches on microorganisms, as well as their metabolism products, are an up-to-date issue. Also, the development of new methods of searching for bactericidal compounds among the products of microbial metabolism becomes even more important. An encouraging trend in the design and improvement of peptide antibiotics or bacteriocins is the use of bacteria of the genus Bacillus.Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus are currently being investigated for the production of bacteriocin-like peptides that have shown a broad spectrum of antagonistic activity against a variety of Gram-positive bacteria including MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) and VRE (vancomycin-resistant Enterococcus faecalis).Having a unique opportunity to check and characterize the properties of the antibacterial agents of the obtained strains (as part of the student project implemented as part of the Student Research Minigrants POB BioS of the Jagiellonian University 2020/2021), using relatively simple microbiological tests. It was decided to try to examine isolates of the genus Bacillus to search for producers of antibacterial compounds and their ulterior characteristics.Bactericidal activity was achieved against the indicator strains Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6633, and Micrococcus luteus ATCC 4698. The tested compounds from the Bacillus are very sensitive. That’s why appropriate conditions for the cultivation and isolation of these factors must be selected for further analysis.Antibacterial activity hasn't been demonstrated for Escherichia coli. Gram-negative pathogenic bacteria are a big problem because there are few antibiotics for them. Finding such an alternative would be a fruitful approach to combating such dangerous bacteria.The study has described strain 212 (Bacillus pumilus) and a series of studies are being carried out to fully characterize the compounds produced by this strain, which may potentially be bacteriocins, due to their bactericidal activity against Staphylococcus aureus.Within the context of this study, the bactericidal activity should be expressed in arbitrary units (AU), defined as the maximum dilution that produced a minimal zone that still gave a visible antagonistic zone, conduct MIC tests, test the sensitivity of bacteriocin-like peptides to proteolytic enzymes, thermal stability, pH and the effect of chemicals. The study investigates this issue by examining an attempt to purify the compound and prepare samples for HPLC separation. Finally, special attention is paid to investigating antagonistic activity against a wider range of indicator microorganisms.