Effects of PPARγ and PPARβ/δ ligands on TGFβ1 – induced fibroblast to myofibroblast transition of human bronchial fibroblasts derived from asthmatic donors

Jedną z najbardziej powszechnych chorób dróg układu oddechowego jest astma oskrzelowa. Jej patogeneza obejmuje zarówno chroniczny stan zapalny, jak również zgrubienie i przebudowę ścian oskrzeli (tzw. remodelling). Pomimo, że remodelling jest złożonym procesem wydaje się, że istotną rolę odgrywa w nim stymulacja miejscowych fibroblastów do różnicowania w miofibroblasty (FMT). Miofibroblasty to komórki wykazujące zwiększoną kurczliwość, głównie ze względu na zdolność wbudowania α-aktyny mięśni gładkich (α-SMA) we włókna naprężeniowe. Ekspresja genu kodującego α-SMA może być wynikiem zwiększonej aktywacji kanonicznej lub niekanonicznej ścieżki sygnalizacyjnej TGF-β1. Jednak mechanizm leżący u podstaw wzmożonego indukowanego TGF-β1 FMT u osób cierpiących na astmę nadal nie jest wyjaśniony. Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu oraz mechanizmu działania ligandów PPARγ -(rozyglitazonu - agonisty i GW9662 - antagonisty) oraz PPARβ/δ (GW501516 - agonisty i GSK0660 - antagonisty) na indukowany przez TGF-β1 proces FMT w fibroblastach oskrzelowych pochodzących od astmatyków w hodowli in vitro.Z przeprowadzonych badań (z wykorzystaniem barwień immunocytofluorescencyjnych, testów immunoenzymatycznych, analiz Western blot, oraz analizy mRNA w czasie rzeczywistym) wynika, że zarówno agoniści jak i antagoniści PPARγ i PPARβ/δ redukują indukowany przez TGF-β1 proces FMT oraz ekspresję i poziom białka α-SMA. Zaobserwowano również obniżenie poziomu innych białek zaangażowanych w proces FMT tj. koneksyny 43 i fibronektyny. W większości eksperymentów zauważono silny addytywny wpływ agonisty i antagonisty zarówno PPARγ jak i PPARβ/δ. Ponieważ efekt wywołany przez agonistów i antagonistów jest podobny, zasugerowano, iż związki te działają niespecyficznie. Uzyskane wyniki nie wykazują wpływu badanych związków na aktywację białka Smad2 należącego do kanonicznej ścieżki sygnalizacyjnej TGFβ/Smad. Analiza poziomu wybranych białek (p38, Akt) przy użyciu metody Western Blot także nie potwierdziła wpływu ligandów na alternatywne drogi sygnalizacji od TGF-β. Zauważono jednak istotny wpływ ligandów PPARβ/δ na poziom białek cytoszkieletu w tym białek zaangażowanych w tworzenie kontaktów zogniskowanych. Zaobserwowany wzrost ekspresji PPAR po zastosowaniu agonistów i antagonistów nie wyklucza też mechanizmu działania ligandów zależnego od PPAR. Uzyskane wyniki wskazują na hamujący wpływ ligandów PPARγ i PPARβ/δ na indukowany przez TGF-β1 proces FMT, jednak nie dają jednoznacznej odpowiedzi na temat molekularnego mechanizmu działania tych związków. Wyniki te mogą dać podstawy do kolejnych badań oraz opracowywania nowych strategii terapeutycznych celujących w przebudowę ścian oskrzeli.

One of the most common diseases of the respiratory tract is bronchial asthma. Its pathogenesis includes both chronic inflammation and thickening as well as remodelling of the bronchial walls. Although the airway remodelling is a complex process, it seems that stimulation of local fibroblast to myofibroblast transitions (FMT) plays an essential role. Myofibroblasts are cells that are able to demonstrate enhanced contractility, due to the incorporation of the α-smooth muscle actin isoform (α-SMA) into the stress fibers. Expression of gene encoding an α-SMA can result from enhanced activation of a canonical or non-canonical TGF-β/Smad signaling pathway. However, the mechanism underlying the enhanced FMT in asthmatics still remains unclear. Results of the experiments (immunocytofluorescence staining, immunoenzymatic tests, Western blot analysis and qPCR) show that both PPARγ and PPARβ/δ agonists and antagonists reduce the efficiency of TGF-β1-induced FMT and the level of α-SMA transcript and protein. A decrease in the level of other proteins involved in the FMT process, i.e. connexin 43 and fibronectin was also observed. In most experiments, a strong additive effect of both PPARγ and PPARβ/δ agonist and antagonist was noted. Because of similarity of the effects caused by PPARγ and PPARβ/δ agonists and antagonists, it has been suggested that the substances act nonspecifically. However, obtained results do not provide influence of PPARγ and PPARβ/δ on the activation of Smad2 protein belonging to the canonic TGFβ/Smad signaling pathway. Analysis of the level of the selected proteins (p38, Akt) using the Western Blot method also did not confirm the effect of ligands on alternative TGFβ signaling pathways. However, a significant impact of PPARβ/δ ligands on the level of cytoskeletal proteins, including focal adhesions, was reported. The observed increase in PPAR expression after using the agonists and antagonists does not exclude a PPAR-dependent mechanism.The results shows inhibitory effect of PPARγ and PPARβ/δ ligands on the TGF-β1 induced FMT process, but do not provide a clear-cut answer regarding the molecular mechanism of action of these compounds. The obtained results build interesting fundaments for the future studies and provide the better development of new therapeutic strategies aimed at remodelling of bronchial wall.