Receiving recombinant proteins MlrA and MlrC Sphingomonas sp. ACM-3962 involved in the biodegradation of microcystin.

Niniejsza praca odnosi się do zagadnienia biodegradacji mikrocystyny przez białka unikalnego szlaku enzymatycznego występującego u szczepu bakterii Sphingomonas sp. ACM-3962 omówionego szczegółowo we wstępie teoretycznym. System degradacji toksyny produkowanej przez sinice jest regulowany przez zespół czterech genów: mlrA, mlrB, mlrC oraz mlrD. Trzy pierwsze kodują białka enzymatyczne, które działając sekwencyjnie hydrolizują wiązania w cząsteczce mikrocystyny, natomiast gen mlrD koduje białko pełniące najprawdopodobniej funkcje transportowe. Część eksperymentalna obejmowała otrzymanie konstruktów genetycznych, ich ekspresję w komórkach E. coli oraz oczyszczanie rekombinowanych białek MlrA i MlrC. Przeprowadzone testy aktywności wykazały, że oba otrzymane białka posiadają aktywność enzymatyczną względem mikrocystyny-LR opisaną dla Sphingomonas sp. ACM-3962 polegającą na linearyzacji jej cyklicznej cząsteczki przez MlrA i prowadzeniu dalszej degradacji do pojedynczych reszt aminokwasowych przez MlrC. Jest to dowód, że postulowane sekwencje otwartych ramek odczytu mlrA oraz mlrC są kompletne i pozwalają na syntezę funkcjonalnych białek. Opracowano również konstrukty dla dwóch mutein białka MlrA pomocnych przy charakterystyce miejsca aktywnego enzymu. Reszty aminokwasowe, których dotyczyły mutacje, znajdują się w obrębie motywu HAIHNE wiążącego jony cynku obecnego w białku MlrA, które na tej podstawie zaszeregowano do pod-podklasy metalopeptydaz (EC 3.4.24). Rozpoczynająca motyw reszta histydynowa oraz kończąca go reszta kwasu glutaminowego zostały zastąpione resztami alaniny (H260A oraz E265A), co w obu przypadkach znosiło aktywność enzymatyczną białka w związku z uniemożliwieniem wiązania jonów metalu. Badano również wpływ usunięcia sekwencji sygnalnej znajdującej się na N-końcu białka MlrA na poziom jego ekspresji i aktywność. W tym celu opracowano konstrukty rozpoczynające się od reszty metioniny w pozycji 38. lub 75. reszty aminokwasowej. Jednak nie udało się otrzymać krótszego funkcjonalnego wariantu MlrA.

The thesis relates to issues of biodegradation of microcystin by a unique pathway of enzyme proteins are present in a strain of Sphingomonas sp. ACM-3962 discussed in detail in the introduction. The system of degradation of toxins produced by cyanobacteria, is regulated by a cluster of four genes: mlrA, mlrB, mlrC and mlrD. The first three encode enzymes proteins that work sequentially and hydrolyze bonds in the molecule of microcystin, whereas mlrD gene encodes a protein likely to fulfill transport functions.Experimental part consisted of receipt of genetic constructs and their expression in E. coli and purification of recombinant proteins MlrA and MlrC. The tests of activity showed that both proteins have received the enzymatic activity that is described for the Sphingomonas sp. ACM-3962 in relation to microcystin-LR involving the linearization of its cyclic molecules by MlrA and conducting further degradation to single amino acid residues by MlrC. This is proof that the postulated sequences of open reading frames mlrA and mlrC are complete and allow the synthesis of functional proteins. Constructs for two muteins of MlrA protein have been developed to help with the characteristics of the active site of the enzyme. Amino acid residues, which concerned the mutations are located within the motif HAIHNE that binding zinc ions. Due to the presence of this motif MlrA was classified in sub-subclass metallopeptidases (EC 3.4.24). Histidine residue in the beginning of the motif and glutamic acid residue terminating it has been replaced with alanine residues alaniny (H260A oraz E265A), which in both cases abolished the enzymatic activity of the protein in conjunction to disabling of metal ions binding. There were studied the impact of removal of signal sequence located at the N-terminus of the protein MlrA on the level of its expression and activity. For this purpose were developed constructs starting with a methionine residue at position 38th or 75th amino acid residue. However, failure to obtain a shorter functional variant of MlrA.