Evaluation of the impact of selected mutations on the spatial structure and function of SLC6 family transporters

Celem niniejszej pracy było zbadanie, metodami in silico, jaki wpływ pojawienie się wybranych mutacji w transporterze GAT1 może mieć na jego strukturę, sposób wiązania GABA oraz ogólną funkcję tego transportera. W części teoretycznej pracy dokonano charakterystyki ogólnej struktury,funkcji, rozmieszczenia w organizmie i roli transporterów z rodziny SLC6. Następnie przedstawiono informacje dotyczące konkretnie transportera GAT1 — jego szczegółową strukturę, funkcję, rolę przenoszonego przez niego substratu, przebieg transportu oraz opis wybranych substancji wpływających na aktywność GAT1. Na koniec scharakteryzowano 11 mutacji, których występowanie stwierdzono w tym transporterze.W części eksperymentalnej pracy przygotowano modele dla transportera typu dzikiego oraz 11 mutantów opisanych w części teoretycznej. Proces ten został przeprowadzony z wykorzystaniem technik modelowania homologicznego oraz fałdowania białek de novo. Jako matryce do modelowania homologicznego wykorzystano ludzki transporter GAT1, transporter dopaminowy DAT pochodzący od muszki owocowej oraz ludzki transporter SERT. Dla każdego wariantu transportera zbudowano modele w stanie otwartym do wewnątrz, okludowanym i otwartym na zewnątrz oraz po jednym modelu fałdowanym de novo. Ogólna struktura każdego z modeli oraz miejsca mutacji zostały przeanalizowane z wykorzystaniem programu PyMOL. Następnie przeprowadzono dokowanie GABA do modeli za pomocą programu Glide pakietu Schrödinger w celu porównania sposobu wiązania tego substratu w typie dzikim i w mutantach. Finalnie przeprowadzono badania dynamiki molekularnej dla transportera typu dzikiego oraz transportera z mutacją Gly297Arg z wykorzystaniem programu Gromacs.Uzyskane wyniki mogą stanowić punkt wyjścia dla dalszych badań nadopisanymi mutacjami transportera GAT1. Badania te pozwoliłyby lepiej zrozumieć rolę tych zmian w patomechanizmie różnorodnych zaburzeń neurologicznych.

The aim of this thesis was to investigate, using in silico methods, theimpact of selected mutations in the GAT1 transporter on its structure, GABAbinding, and overall function.The theoretical part of the thesis provided a general characterization ofthe structure, function, distribution in the body and role of SLC6 familytransporters. Subsequently, specific information about the GAT1 transporterwas presented, including its detailed structure, function, the role of the substrate it carries, transport process and a description of selected substancesinfluencing GAT1 activity. Finally, 11 mutations found in this transporterwere characterized.In the experimental part of the thesis, models for the wild-type transporter and 11 mutants described in the theoretical part were prepared. This process was conducted using homology modeling and de novo protein folding techniques. The human GAT1 transporter, the dopamine transporter (DAT) from fruit fly, and the human serotonin transporter (SERT) were used as templates for homology modeling. For each variant of the transporter, models in the open-in, occluded and open-out states, as well as one de novo folded model were built. The overall structure of each model and the mutation sites were analyzed using the PyMOL program. Docking of GABA to the models was performed using the Glide program of the Schrödinger suite to compare the binding mode of this substrate in the wild-type and mutant forms. Finally, molecular dynamics simulations were conducted for the wild-type transporter and the Gly297Arg mutation using the Gromacs program. The obtained results can serve as a starting point for further researchon the described mutations in the GAT1 transporter. Such studies wouldcontribute to a better understanding of the role of these changes in the pathomechanism of various neurological disorders.