Effect of dibutyl phthalate on juxtacrine signaling in rat male gonad

Sygnalizacja jukstakrynowa to konserwatywna droga komunikacji pomiędzy komórkami, w której ligand (Delta lub Jagged) znajdujący się w błonie jednej z komórek, aktywuje receptor (Notch) zlokalizowany na powierzchni komórki sąsiadującej. Skutkuje to aktywacją transkrypcji genów efektorowych m.in Hes oraz Hey. Szlak sygnalizacyjny Notch jest niezwykle istotny w procesach rozwoju organizmu oraz w prawidłowym funkcjonowaniu wielu układów, w tym męskiego układu rozrodczego. Badania ostatnich lat coraz silniej wskazują na udział czynników środowiskowych w powstawaniu zaburzeń funkcji rozrodczych u zwierząt i ludzi. Wśród tych czynników istotne znaczenie mają związki hormonalnie czynne, czyli substancje oddziałujące na gospodarkę hormonalną. Należy do nich ftalan dibutylu (DBP) wykazujący aktywność antyandrogenową. Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu DBP na ekspresję oraz lokalizację Notch1, DLL4, HES5 i HEY1 zaangażowanych w sygnalizację jukstakrynową w gonadzie męskiej. Materiałem badawczym były eksplanty jąder dorosłych szczurów Wistar. Eksplanty inkubowane były in vitro w medium z dodatkiem DBP w stężeniach 10-9, 10-8, 10-5, 10-4 M przez 24 godziny. Do analizy ekspresji transkryptów genów Notch1, Dll4, Hes5 i Hey1 użyto metody qRT-PCR w czasie rzeczywistym. Względna ekspresja białek szlaku sygnalizacyjnego Notch została zbadana z wykorzystaniem analizy Western blot, natomiast lokalizację tych białek w jądrach określono z zastosowaniem metody immunohistochemicznej. Zbadano również wpływ DBP na apoptozę poprzez analizę immunoekspresji aktywnej formy kaspazy 3. W eksplantach poddanych działaniu 10-5 i 10-4 M DBP wykazano wzrost ekspresji mRNA Notch1, Dll4 oraz Hey1 (p < 0,01; p < 0,001), podczas gdy ekspresja Hes5 nie uległa zmianie. Analiza Western blot potwierdziła obecność białek szlaku sygnalizacyjnego Notch w eksplantach jąder, natomiast analiza densytometryczna wykazała wzrost ekspresji białek NICD, DLL4 oraz HEY1 (p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001) po inkubacji eksplantów z 10-5 i 10-4 M DBP przy jednoczesnym spadku ekspresji białka HES5 (p < 0,05) po 10-4 M DBP. Barwienie immunohistochemiczne potwierdziło obecność wszystkich badanych białek sygnalizacji jukstakrynowej zarówno w nabłonku plemnikotwórczym, jak i tkance interstycjalnej. Znaczny wzrost immunoekspresji NICD, DLL4 oraz HEY1 widoczny był w obu przedziałach jąder poddanych działaniu DBP. Analiza ekspresji aktywnej formy kaspazy 3 wykazała istotny wzrost liczby plemnikotwórczych komórek apoptotycznych w tkance poddanej działaniu 10-5 M DBP (p < 0,001). Podsumowując, uzyskane wyniki świadczą, że DBP zaburza sygnalizację jukstakrynową w gonadzie męskiej szczura, co może w istotny sposób wpływać na prawidłowy przebieg takich procesów jak spermatogeneza czy steroidogeneza.

Juxtacrine signaling is a conservative way of communication between cells wherein the ligand (Delta-like or Jagged) located in the membrane of one cell activates the receptor (Notch) situated on the surface of the neighboring cell. This results in the activation of transcription of the effector genes Hes and Hey. The Notch signaling pathway is extremely important in processes related to the development of the organism and in the proper functioning of many systems including the male reproductive system. Numerous studies indicate that reproductive system is affected by environmental factors of which endocrine disrupting chemicals are substances that affect endocrine system. One of such chemicals is dibutyl phthalate (DBP) which has antiandrogen activity. The aim of this study was to investigate the influence of DBP on the expression and localization of Notch1, DLL4, HES5 and HEY1 involved in juxtacrine signaling in the male gonad. The study was performed on testicular explants isolated from adult male Wistar rats. Explants were exposed in vitro to 10-9, 10-8, 10-5, 10-4 M DBP for 24 hours. Analysis of Notch1, Dll4, Hes5 and Hey1 mRNA expression was carried out by real-time qRT-PCR. To examine the expression of Notch signaling proteins Western blot analysis was used while the localization of these proteins was determined using immunohistochemistry. The effect of DBP on apoptosis was examined by analyzing cleaved caspase 3.Increased expression of Notch1, Dll4 and Hey1 was shown in testicular explants exposed to 10-5 and 10-4 M DBP (p < 0,01; p < 0,001), while there was no significant change in the expression of Hes5. Western blot analysis confirmed the presence of Notch signaling compounds in all testicular explants. Furthermore, densitometric analysis demonstrated upregulation of NICD, DLL4 and HEY1 (p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001) after 10-5 and 10-4 M DBP exposure and downregulation of HES5 (p < 0,05) after 10-4 M DBP. Immunohistochemistry revealed the presence of juxtacrine signaling proteins in seminiferous epithelium as well as in the insterstitial tissue. Increased immunoexpression of Notch1, DLL4 and HEY1 was seen in both testicular compartments after DBP exposure. Analysis of cleaved caspase 3 showed a significant increase in the number of apoptotic germ cells after 10-5 M DBP exposition (p < 0,001). In summary, the obtained results indicate that DBP affects juxtacrine signaling in rat testis that may lead to disturbed communication between testicular cells and may affect such processes as spermatogenesis and steroidogenesis.