Production and characterization of murine anti-HA-tag monoclonal antibodies using hybridoma technology

Metka HA jest nonapeptydem, wykorzystywanym między innymi jako antygen dla przeciwciał anty-HA do detekcji oraz oczyszczania rekombinowanych białek za pomocą chromatografii powinowactwa. Istotnym ograniczeniem zastosowania komercyjnie dostępnych przeciwciał anty-HA jest ich cena. Celem pracy była optymalizacja procesu produkcji i oczyszczania przeciwciał, opartego o wyprowadzoną w ramach pracy linię komórek hybrydoma. Fuzja komórek izolowanych ze śledziony myszy wcześniej immunizowanej białkiem KLH (z ang. Keyhole Limpet Hemocyanin, hemocyjanina ślimaka przewiertkowego) zawierającym kowalencyjnie sprzężoną metkę HA (KLH-HA) z komórkami linii mysiego szpiczaka Sp2/0 umożliwiła uzyskanie unieśmiertelnionego klonu komórek hybrydoma (5G2G11G7G9) stabilnie syntetyzujących przeciwciała anty-HA-tag. Procedura oczyszczania przeciwciał z pożywek pobranych znad komórek klonu 5G2G11G7G9 z użyciem chromatografii powinowactwa umożliwiła uzyskanie oczyszczonych preparatów przeciwciał w stężeniu wystarczającym do zastosowań laboratoryjnych. Analizy specyficzności przeciwciał z wykorzystaniem techniki Western blot wykazały ich powinowactwo względem zdenaturowanych białek, posiadających metkę HA (BSA-HA i latrofiliny-1, receptora klasy aGPCR (ang. adhesive G protein-coupled receptor)). Natomiast nie udało się jednoznacznie wykazać ich użyteczności w immunoprecypitacji. Uzyskane wyniki sugerują możliwość zastosowania przeciwciał anty-HA-tag produkowanych przez klon komórek hybrydoma 5G2G11G7G9 do detekcji latrofiliny-1 posiadającej metkę HA z wykorzystaniem analizy Western blot, jednak wskazują na konieczność optymalizacji procedury immunoprecypitacji natywnych fragmentów tego białka.

HA-tag is a nonapeptide, which is used as an antigen for anti-HA-tag antibodies in protein purification via affinity chromatography. The application of commercial anti-HA-tag antibodies in laboratory practice is limited by their price. The aim of the M.Sc. project was to optimize the production and purification of murine monoclonal anti-HA-tag antibodies produced in-house using hybridoma technology. Fusion of the cells isolated from the spleen of a mouse, previously immunized with HA-conjugated KLH (KLH-HA) with Sp2/0 murine myeloma cells, resulted in obtaining an immortal hybridoma cell clone (5G2G11G7G9) that stably synthesized anti-HA-tag antibodies. The purification of the media collected from the 5G2G11G7G9 clone with affinity chromatography yielded the purified, high-quality antibody preparations in the concentrations potentially sufficient for laboratory applications. Characterization of the obtained antibodies with the Western blot technique demonstrated their affinity for denatured HA-tagged proteins (BSA-HA and latrophilin-1, an adhesive G protein-coupled receptor). However, the specificity of these antibodies against the native HA-tag-labeled extracellular fragment of latrophilin-1 was not detectable. These data suggest the potential use of anti-HA-tag antibodies produced by the hybridoma cell clone 5G2G11G7G9 for the immunoblotting of latrophilin-1, but indicate the need to optimize procedures of the immunoprecipitation of native fragments of this protein.