Klonowanie, ekspresja, izolacja, oczyszczanie i badania kinetyczne β-D-glukuronidazy

β-D-glukuronidaza jest białkiem z grupy hydrolaz glikozydowych, katalizujących rozkład wiązania glikozydowego przez hydrolizę. Modyfikowane glikozydazy wykazują także zdolność tworzenia wiązań glikozydowych. Z tego względu β-D-glukuronidaza może znaleźć zastosowanie jako enzym specyficznie katalizujący generację O- i S-glikozydowych pochodnych kwasu β-D-glukuronowego, które mogą się stać glikomimetykami lub inhibitorami kompetycyjnymi ludzkich glikozydaz i w ten sposób służyć w celach medycznych lub biochemicznych. Celem pracy było sklonowanie genu kodującego β-D-glukuronidazę, pochodzącego z Dictyoglomus thermophilum, oraz jego ukierunkowana mutageneza, a następnie ekspresja genów w komórkach bakteryjnych, izolacja, oczyszczenie oraz testy kinetyczne otrzymanych wariantów białka, a także próba zastosowania enzymu w syntezie oraz krystalizacja. Do amplifikacji genów wykorzystano technikę PCR, zaś do ich ekspresji wektor ekspresyjny i hodowlę bakteryjną. Otrzymane białka oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa. Badania kinetyczne wykazały, że β-D-glukuronidaza jest specyficzna dla kwasu β-D-glukuronowego, a optymalne dla jej działania są temperatura 80°C oraz pH 5.0 dla wariantu dzikiego i pH w zakresie 6.0-9.0 dla wariantu z mutacją. Udało się ponadto wyznaczyć parametry kinetyczne obu enzymów, a próby syntezy udowodniły ich zdolność do przeprowadzania O- i S-glikozylacji. Krystalizacja metodą dyfuzji przez fazę gazową techniką siedzącej kropli zaowocowała otrzymaniem kryształów, dla których wykonano pomiary dyfraktometryczne.

β-D-glucuronidase is a protein belonging to glycoside hydrolases, which cleave the glycosidic bond via hydrolysis. Modified glycosidases are also able to create glycosidic bonds. Therefore β-D-glucuronidase can be applied as an enzyme specifically catalyzing generation of O- and S-glycoconjugates of β-D-glucuronic acid, potential glycomimetics or competitive inhibitors for human glycosidases with application in medicine or biochemistry.The aim of the project was to clone the gene encoding β-D-glucuronidase, originated from Dictyoglomus thermophilum, and to conduct site-directed mutagenesis and afterwards to express the genes in bacteria cells, isolate and purify them and to provide kinetic studies of the obtained protein variants as well as to apply the enzymes in synthesis and to find the proper conditions for their crystallization. PCR technique was used to amplify the genes, whereas their expression in bacteria was held with help of expression vector. Obtained proteins were purified by affinity chromatography. Kinetic studies showed that β-D-glucuronidase is specific for β-D-glucuronic acid and the optimal conditions for its reactions are temperature of 80°C and pH of 5.0 for the wild type and of 6.0-9.0 for the mutant. Moreover it was possible to estimate kinetic parameters for both enzymes and the synthesis trials confirmed their capability to conduct O- and S-glycosylation. Crystallization using vapor diffusion methods with sitting drop technique allowed to obtain crystals which underwent diffraction studies.