Development of a protocol for determining the local concetration of saturated fatty acids used as Raman reporters in cells

Dokładna analiza przemian metabolicznych na poziomie pojedynczych komórek wymaga zastosowania precyzyjnej i wysokoczułej metody, pozwalającej na jednoczesną ocenę ilościową i jakościową. Aby umożliwić śledzenie metabolizmu dość trudnej w analizie grupy związków chemicznych, jakimi są właśnie lipidy, postanowiono opracować technikę, która umożliwi wyznaczanie lokalnego stężenia związków lipidowych w komórkach, a nawet w pojedynczych kroplach lipidowych.Podstawowym elementem stworzenia owej metody, było zastosowanie podejścia znacznikowego w spektroskopii ramanowskiej. Jako bioortogonalnego znacznika użyto deuterowanego kwasu palmitynowego (d31PA), którego zastosowanie staje się coraz bardziej powszechne w tego typu badaniach. Dzieje się tak, ponieważ charakterystyczne pasma, pochodzące od wiązań C-D, które występują w cichym zakresie na widmie ramanowskim (1800-2700 cm-1), umożliwiają precyzyjniejszą identyfikację analizowanych związków lipidowych. Jest to możliwe, ponieważ w tym zakresie nie występują pasma od innych biomolekuł. Przy odpowiednio dobranych warunkach (stężenie i czas inkubacji), związki te także nie powodują cytotoksyczności. Stworzenie krzywej kalibracyjnej na podstawie pomiarów ramanowskich roztworu d31PA w DMSO, pozwoliło wyznaczyć równanie, umożliwiające oszacowanie stężenia lipidów egzogennych na poziomie komórkowym oraz na poziomie kropli lipidowych. Dodatkowo, z pomocą obrazowania ramanowskiego, przeprowadzono molekularną analizę jakościową lipidów endogennych i egzogennych w komórkach, co pozwoliło zaobserwować zaskakująco duży wkład od białek cytochromowych. Wzrost zawartości białek hemowych w wyniku wychwytu d31PA, świadczy o aktywacji metabolizmu mitochondrialnego w komórkach. Wszystkie badania przeprowadzono na populacji komórek nowotworowych linii HeLa, wywodzących się z raka szyjki macicy. Opracowana metoda posiada potencjał, aby stać się przełomowym narzędziem w diagnostyce laboratoryjnej, usprawniającym efektywniejszą obserwację zmian towarzyszących rozwojowi wielu chorób związanych z metabolizmem lipidów. Ponadto technika ta może potencjalnie zostać wykorzystana jako biomarker w badaniach, sprawdzających reakcję organizmu na działanie określonych leków.

Accurate analysis of metabolic changes at the single-cell level requires the use of a precise and highly sensitive method that allows for simultaneous quantitative and qualitative assessment. To track the metabolism of challenging chemical compounds such as lipids, a technique was developed to quantify their local concentration within cells and even in individual lipid droplets.The basis of creating this method was the use of labeled Raman imaging. Deuterated palmitic acid (d31PA) was used as a biorthogonal marker, which is becoming increasingly common in this type of research. This is because the characteristic bands originating from C-D bonds, which occur in the so-called “silent range” in the Raman spectrum (1800-2700 cm-1), enable more precise identification of the analyzed lipid compounds. This is possible because there are no bands from other biomolecules in this range. Under appropriately selected conditions (concentration and incubation time), these compounds also do not cause cytotoxicity. The creation of a calibration curve based on Raman measurements of d31PA solution in DMSO enabled us to determine an equation that allows for estimating the concentration of exogenous lipids at both the cellular and lipid droplet levels. Additionally, using Raman imaging, a qualitative molecular analysis of endogenous and exogenous lipids in cells was performed, which allowed us to observe a surprisingly significant contribution from cytochrome proteins. The increase in the content of heme proteins resulting from d31PA uptake indicates the activation of mitochondrial metabolism in cells. All studies were performed on the HeLa cancer cell line population, derived from cervical cancer.The developed method has the potential to become a breakthrough tool in laboratory diagnostics, facilitating more effective observation of changes associated with the development of many diseases related to lipid metabolism, and also in a quantitative manner. Additionally, this technique can help track lipids, which could potentially serve as a biomarker in research assessing the body's response to specific drugs.