Attemps at production of recombinant bacteriocin BacSp222 as a fusion protein in Escherichia coli

Bakteriocyny są rybosomalnie syntetyzowanymi białkami i peptydami produkowanymi przez bakterie posiadającymi aktywność antybakteryjną. Pełnią one ważną rolę w ekologicznych oddziaływaniach między bakteriami oraz wykazują duży potencjał zastosowania w przemyśle i medycynie. Przedmiotem przedstawionej pracy magisterskiej jest próba otrzymania rekombinowanej bakteriocyny BacSp222. Bakteriocyna ta jest produkowana przez oportunistyczny patogen Staphylococcus pseudintermedius 222. Ma długość 50 reszt aminokwasowych. Wykazuje działanie bakteriobójcze wobec szeregu bakterii Gram dodatnich. Podjęto próby uzyskania układu ekspresyjnego umożliwiającego otrzymanie aktywnej biologicznie bakteriocyny poprzez wykorzystanie produkcji białek fuzyjnych, które umożliwiłby osiągnięcie wydajnej produkcji. Zaprojektowano konstrukty genetyczne umożliwiające otrzymanie dwóch różnych białek fuzyjnych. Białka te miały być produkowane w postaci ciałek inkluzyjnych. Takie podejście ma chronić produkowane białko przed proteolizą i ograniczać jego toksyczność względem komórek producenckich.Część doświadczalna obejmowała uzyskanie pożądanych konstruktów genetycznych, ich testową ekspresję w komórkach Escherichia. coli w celu porównania poziomu produkcji oraz oczyszczanie białka fuzyjnego. Dokonano doświadczalnego wyboru układu charakteryzującego się wyższym poziomem produkcji białka fuzyjnego. W celu potwierdzenia tożsamości peptydu uzyskanego w wyniku oczyszczania dokonano oznaczenia sekwencji N-końcowej oraz wyznaczono masę przy użyciu spektometrii mas. Przeprowadzony test aktywności antybakteryjnej świadczy o uzyskaniu aktywnego peptydu. Uzyskany preparat charakteryzuje się niską czystością oraz niskim stężeniem.Przedstawiona w pracy procedura oczyszczania wymaga dalszej optymalizacji w celu uzyskania preparatu o wyższej czystości i stężeniu, umożliwiającego przeprowadzenie badań biochemicznych i strukturalnych.

Bacteriocins are ribosomally synthesized peptides and proteins produced by bacteria which exhibit antibacterial activity. They are ecologically important and have a potential for an application in food industry and medicine. This master thesis presents attempts of production of the recombinant protein BacSp222. This bacteriocin is produced by opportunistic pathogen Staphylococcus pseudintermedius 222. BacSp222 is bactericidal towards Gram positive bacteria. Attempts for creating a heterologous expression system to gain active recombinant BacSp222 are presented.Two genetic constructs was created to enable producing bacteriocin as a recombinant fusion protein. These fusion proteins were created to lower the toxicity of bacteriocin. Also the possibility of proteolysis was reduced thanks to production of the fusion proteins as inclusion bodies.Experimental part consistsof constructing the expression vector, test expression of fusion proteins and purification of recombinant bacteriocin. Experimental selection of more efficient expression system was performed. To affirm the presence of BacSp222 in obtained sample N–terminal sequencing was performed. Mass spectrometry was used to assign the mass of the peptide. Antibacterial activity test showed that the obtained preparation exhibits the activity.The purification procedure presented in the master thesis needs to be optimized in order to obtain the bacteriocin in higher purity to enable carry out additional biochemical and structural experiments.