Study of D1 dopamine receptor interaction with G protein alpha subunit

Receptory sprzężone z białkami G stanową największą rodzinę białek błonowych. W ludzkim genomie zidentyfikowano ponad 800 genów kodujących te receptory. Receptory metabotropowe aktywowane są przez zewnętrzny sygnał w formie ligandu lub innego mediatora. Związanie ligandu wywołuje zmiany konformacyjne receptora, skutkujące aktywacją białka G. Mechanizmy molekularne oddziaływania receptorów z białkami G pozostają nierozpoznane. Wciąż istnieją pytania bez odpowiedzi: czy białko G wiąże się z receptorem przed czy po aktywacji samego receptora, czy oligomeryzacja receptorów metabotropowych wywołuje zmiany w rozpoznawaniu liganda czy w związaniu białka G.Celem niniejszej pracy była weryfikacja hipotezy dotyczącej prekompleksowania receptorów i białek G. Odziaływanie badano w układzie modelowym złożonym z receptora dopaminowego D1 oraz podjednostki αsL białka G. W badaniach wykorzystano barwnik FlAsH rozpoznający motyw sekwencji wprowadzony do trzeciej pętli wewnątrzkomórkowej (IC-3) oraz C-końca receptora dopaminowego. Metoda znakowania barwnikiem FlAsH polega na wiązaniu się małej, arsenowej pochodnej fluoresceiny do sześcioaminokwasowej sekwencji Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys (CCPGCC). Uzyskany stosunek sygnału do szumu dla znacznika FlAsH jest bardzo niski. W celu potwierdzenia specyficznego znakowania potrzebne są dalsze optymalizacje rozpoznawanej sekwencji i/lub warunków, w których przeprowadza się znakowanie. Tworzenie kompleksów receptora z białkiem G badano poprzez pomiary rezonansowego transferu energii techniką obrazowania czasów życia fluorescencji (FRET-FLIM). W celu detekcji prekompleksów wykorzystano badane białka połączone z białkami fluorescencyjnymi Citrine oraz mCherry. Uzyskane wyniki potwierdziły oddziaływanie pomiędzy białkami w badanym układzie. Podjęto także próbę stworzenia układu modelowego na bazie fluorescencyjnego dopełnienia (BiFC) do badania homo- i heterodimeryzacji receptorów dopaminowych D2 i/lub D1. W celu ułatwienia reasocjacji fluoroforu wydłużono C-końcowy fragment receptora D2. Układ ten pozwolił na obserwację homodimerów receptora D2 w komórkach HEK293.

G protein-coupled receptors represent largest family of integral membrane proteins. In the human genome were identified more than 800 GPCR genes. The G protein-coupled receptor is activated by an external signal in the form of a ligand or other signal mediator. This creates a conformational change in the receptor, causing activation of a G protein. Molecular mechanism of receptor interactions with G proteins remains unrecognized. There are still unanswered questions: whether G proteins couple before or after receptor activation, whether GPCR oligomerization involves changes in ligand recognition or G protein-coupling. This thesis summarizes an attempt to test the hypothesis of receptor-G protein precoupling using D1 dopamine receptor and αsL subunit of G protein. FlAsH-EDT2 was used as a site-specific label of the III cytoplasmic loop and C-terminal of the dopamine receptor. This method is based on the binding of small fluorescein derivative, called fluorescein arsenical hairpin binder (FlAsH), to a short peptide sequence Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys (CCPGCC). The signal to noise ratio of the FlAsH dye is relatively low. Further optimization of labeling motif and/or labeling conditions appears to be required if the specificity of labeling is to be improved. Precoupling was investigated by Forster resonance energy transfer (FRET) measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Chimeras with the fluorescent proteins Citrine and mCherry were used to detect precoupling. The results confirmed interaction between proteins.An attempt was also made to create a fluorescence complementation-based system for the study of D2 and/or D1 dopamine receptors homo- and heterodimers. The C-terminus of D2 dopamine receptor was extended to facilitate fluorescence complementation. D2 homodimers have been visualized in HEK293 cells.