Detection and identification of visible-light-induced DNA breaks in model systems

Analiza i rzetelne rozumienie stabilności DNA stanowi kluczowy aspekt badań biochemicznych. Przez lata zidentyfikowane zostały liczne czynniki uszkadzające, co wykorzystane zostało zarówno w rozumieniu etiologii procesów patologicznych jak i w ich leczeniu. Jednocześnie wiele aspektów komórkowej odpowiedzi na uszkodzenia i utrzymywania stabilności genomu pozostaje niezbadanych, co sprawia, że niezbędne jest opracowywanie nowych metod kontrolowanego wywoływania uszkodzeń DNA.Jedną z takich metod jest indukcja pęknięć DNA przy użyciu światła widzialnego, poprzez naświetlanie jądra komórkowego niepoddawanego działaniu egzogennych fotouczulaczy wiązką laserową. Udowodniono, że metoda ta efektywnie wywołuje zarówno pęknięcia jedno- jak i dwuniciowe, jednak fizykochemiczny mechanizm jej działania pozostaje nieznany. W poniższej pracy zaproponowano dwie hipotezy: reakcje zależne od reaktywnych form tlenu produkowanych przez endogenne fotouczulacze oraz bezpośrednią interakcję DNA ze światłem widzialnym. Celem pracy była weryfikacja tych hipotez w wybranych układach modelowych: hodowli komórek, DNA plazmidowym oraz oligonukleotydach. Badania na komórkach wykazały, że światło widzialne wywołuje pęknięcia dwuniciowe i jednoniciowe z dużą efektywnością. Ogniska naprawcze dla pęknięć jedno- i dwuniciowych nie wykazują kolokalizacji. Udowodniono, że reakcje degradacji DNA indukowane światłem widzialnym mogą być całkowicie niezależne od metabolizmu komórkowego. DNA plazmidowe (o wielkości ok. 4700 par zasad) i oligonukleotydy (o wielkości 18 par zasad) ulegały gwałtownej degradacji pod wpływem naświetlania w obecności wybranego fotouczulacza – ryboflawiny. Możliwe było wywołanie obu typów pęknięć, a brak najbardziej podatnej na utlenienie guaniny nie zwiększał stabilności DNA. W przypadku naświetlania cząsteczek bez fotouczulacza DNA plazmidowe degradowało powoli, jednak zauważalnie i z intensywnością istotnie większą niż rozkład termiczny. Reakcji tej nie zaobserwowano dla oligonukleotydów co związane może być z ich jednoniciową strukturą lub brakiem udziału fotouczulających zanieczyszczeń.

Examining and thoroughly understanding the stability of DNA is a vital aspect of biochemical research. Throughout the years, numerous damaging agents have been identified and these findings have been utilized in both understating the etiology of pathological processes and treating them. At the same time, many aspects of cellular response to the damage and maintenance of genome stability are yet to be researched, which makes it necessary to develop new methods of controlled damage induction. One of such methods is break induction with visible light by irradiating cell nucleus not subjected to exogenous photosensitizers with a laser beam. This method has been proved effective at inducing both single and double strand breaks, however the physicochemical mechanism of damage induction remained unknown. In this work, two hypotheses were proposed: damage dependent on reactive oxygen species produced by endogenous photosensitizers and direct interaction between DNA and visible light. The purpose of this work was to verify these hypotheses in selected model systems: cell lines, plasmid DNA and oligonucleotides.Experiments on cells have shown that visible light causes single and double strand breaks with high effectiveness. Repair foci for single and double strand breaks did not colocalize.It was proven that the degradation induced by visible light may be completely independent of cell metabolism. Plasmid DNA (containing about 4700 base pairs) and oligonucleotides (18 base pairs) rapidly degraded when irradiated in the presence of a known photosensitizer – riboflavin. Induction of both types of breaks was possible and the lack of guanine, which is prone to oxidation, did not increase DNA stability. In the case of irradiation of molecules without the photosensitizer, plasmid DNA degraded slowly, but noticeably and with intensity significantly higher than thermal decay. This reaction was not observed for oligonucleotides, which may be connected to their single-stranded structure or the lack of photosensitizing impurities.