Optimization of expression and purification of proteins: Cmr1, Cmr6 and Cmrh of the CRISPR-Cas system of Porphyromonas gingivalis W83

System CRISPR-Cas stanowi szeroko rozpowszechniony wśród prokariontów adaptacyjny, dziedziczny, bazujący na zjawisku interferencji małych RNA układ zapewniający obronę przeciwfagową i przeciwplazmidową, jak również sprawujący kontrolę nad już obecnymi, rezydentnymi fagami, plazmidami czy transpozonami. Przypuszcza się również, że system ten może być wykorzystywany przez bakterie do kontroli ekspresji poszczególnych białek, podobnie jak uprzednio opisany mechanizm interferencji RNA u Eucaryota. CRISPR-Cas umożliwia integrację fragmentów obcych kwasów nukleinowych do genomu bakterii, by następnie wykorzystywać je jako matrycę do tworzenia RNA wchodzącego w skład kompleksów białko-RNA, pozwalających na selektywną degradację elementów homologicznych w matrycy RNA/DNA. Wyróżnia się kilka typów systemów CRISPR‑Cas, jednak w niniejszej pracy skupiono się na typie III-B, ponieważ występuje on u badanej bakterii Porphyromonas gingivalis. Celem pracy była optymalizacja egzogennej ekspresji,a następnie oczyszczania trzech białek należących do modułu RAMP: Cmr1, Cmr6 oraz Cmrh, pochodzących z P. gingivalis W83 w bakteriach Escherichia coli. Ten patogenny gatunek bakterii jest jednym z głównych czynników etiologicznych paradontozyu ludzi, ale wykazano również związek zakażeń z rozwojem schorzeń takich jak: reumatoidalne zapalenie stawów, choroby układu krążenia czy zachłystowe zapalenie płuc.

CRISPR-Cas is a widespread prokaryotic system providing adaptive, hereditary, small RNA based immunity against phages and plasmids, as well as maintaining control over resident phages, plasmids and transposons. Moreover, it was suggested that the system may act similarly to well described RNA interference in Eucaryota, modulating expression of endogenous bacterial genes. CRISPR-Cas enables integration of foreign nucleic acids into host genome and subsequent production of crRNAs containing these elements, which are encapsulated in effector protein complexes, targeting and cleaving foreign DNA/RNA at homologous sites. In the current work type III-B of CRISPR‑Cas system was described, as it seem to be vital for Porphyromonas gingivalis bacteria. The aim of this thesis was to develop and optimize exogenous expression and purification Escherichia coli – based system for three RAMP module proteins: Cmr1, Cmr6 and Cmrh, which originated from Porphyromonas gingivalis W83. Said pathogenic bacterial genus is one of the major etiological factors of periodontitis. Moreover, it has been proven that infection with these bacteria may result in development of rheumatoid arthritis, cardiovascular diseases and aspiration pneumonia.