The role of N4BP1 protein interaction with NONO and SFPQ

N4BP1 zostało po raz pierwszy opisane jako białko wiążące E3 ligazę ubikwityny NEDD4. Dzięki domenie nukleazowej uczestniczy w odpowiedzi na niektóre infekcje wirusowe poprzez degradację wirusowego mRNA. N4BP1 wpływa również na odpowiedź immunologiczną poprzez pośrednie i bezpośrednie hamowanie szlaku sygnałowego NF-κB. Najnowsze badania ukazują rolę N4BP1 w regulacji rozwoju łuszczycy poprzez hamowanie proliferacji keratynocytów oraz rekrutacji neutrofili do komórek ze zmianami łuszczycowymi. N4BP1 podlega degradacji proteolitycznej z udziałem kaspazy 8 oraz parakaspazy MALT1. Przeprowadzone w Zakładzie Biochemii Ogólnej analizy immunoprecypitacji i spektrometrii masowej wykazały występowanie białek, które mogą oddziaływać z N4BP1. Wykryto m.in powiązane funkcjonalnie białka NONO, SFPQ oraz RBM14 w kompleksie z N4BP1. Celem niniejszej pracy było potwierdzenie interakcji N4BP1 z powyższymi białkami w układach nadekspresji sekwencji kodującej NONO, SFPQ oraz RBM14. Wykonano analizy wpływu N4BP1 na długie niekodujące RNA TERRA, które wpływają na stabilność telomerów. Zaproponowano możliwy mechanizm regulacji stabilności TERRA przez N4BP1. W celu realizacji pracy przygotowano plazmidy pcDNA3.1 mycHis zawierające sekwencje kodujące NONO, SFPQ oraz RBM14. Analizy immunoprecypitacji wykazały, że badane białka ze względu na występujące metki nie oddziałują z N4BP1. Za pomocą przeciwciał anty-NONO potwierdzono natomiast interakcję N4BP1 z endogennym białkiem. Badania relatywnej ekspresji wykazały istotny biologicznie wzrost transkryptów TERRA dla komórek o zwiększonym poziomie białek N4BP1 WT oraz SFPQ, co może być spowodowane uwalnianiem części subtelomerowych transkryptów TERRA.

N4BP1 was described as a protein that binds NEDD4 ubiquitin ligase. Nuclease domain of N4BP1 participates in the response to certain viral infections by degrading viral mRNA. The N4BP1 also affects the inflammation through a direct and indirect inhibition of the NF-κB signaling pathway. Recent studies reveal a role for N4BP1 in the regulation of psoriasis by inhibiting keratinocyte proliferation and neutrophil recruitment to psoriatic cells. The level of N4BP1 is modulated by degradation pathways that includes caspase 8 and paracaspase MALT1. Immunoprecipitation and mass spectrometry analyses performed in the Department of General Biochemistry revealed the presence of novel proteins that may interact with N4BP1. Functionally related proteins NONO, SFPQ, and RBM14 were detected. The objective of the thesis was to confirm the interaction of N4BP1 with detected proteins. The effect of N4BP1 on the long non-coding RNA named TERRA, which affects telomere fragility was analyzed. Based on obtained here results a possible mechanism for the regulation of TERRA stability by N4BP1 was proposed. In order to perform experiments pcDNA3.1 mycHis plasmids containing NONO, SFPQ, and RBM14 coding sequences were prepared. Immunoprecipitation analyses showed that the proteins do not interact with N4BP1 due to the presence of the tags. However, the interaction of N4BP1 with the endogenous protein was confirmed using anti-NONO antibodies. Relative expression studies showed a significant increase in TERRA transcripts for cells containing the increased level of N4BP1 WT with SFPQ, which may be due to the release of the parts of subtelomeric transcripts.