Characterization of the roles of MATR3 and PSF proteins in Rev-dependent HIV RNA export

Ludzki wirus niedoboru odporności HIV (ang. Human Immunodeficiency Virus), lentiwirus należący do rodziny Retroviridae, jest przyczyną rozwoju zespołu upośledzenia odporności AIDS (z ang. Acquired Immunodeficiency Syndrome). Choroba ta jest odpowiedzialna za jedną z największych pandemii XX i XXI wieku. Cykl replikacyjny HIV-1 kontrolowany jest zarówno przez czynniki wirusowe jak i komórkowe. Wirus wykorzystuje proces alternatywnego splicingu, co skutkuje powstaniem dwóch klas wirusowych transkryptów: krótkie pozbawione intronów w procesie splicingu cząsteczki RNA (ang. multiply-spliced RNA), które są natychmiast eksportowane do cytoplazmy oraz długich transkryptów zawierających introny (z ang. unspliced RNA and singly-spliced RNA). Długie transkrypty HIV zawierają sekwencje RRE (Rev Responsive Element) i pozostają w jądrze komórkowym, ze względu na zawarte w nich dodatkowe sekwencje INS (ang. Instability Elements). Aby zaszedł transport tych transkryptów do cytoplazmy wymagana jest obecność wirusowego białka Rev (ang. Regulator of expression of viron proteins). Wcześniejsze badania wykazały, że różne komórkowe czynniki, takie jak białko macierzy jądrowej matryna 3 (MATR3) oraz PSF są ko-faktorami białka Rev, jednak ich dokładna rola nie została określona.W pracy tej zbadano rolę białek komórkowych MATR3 oraz PSF w Rev-zależnym eksporcie transkryptów zawierających sekwencje RRE/INS. Pierwszym celem było uzyskanie stabilnych linii komórkowych Jurkat_lacO_shM3, Jurkat_lacO_shPSF oraz Jurkat_lacO_shLuc wyrażających pod kontrolą indukowalnego IPTG promotora shRNA specyficzne względem, odpowiednio, MATR3, PSF oraz lucyferazy. Cel ten został osiągnięty poprzez transdukcję lentiwirusami zawierającymi konstrukty shRNA. Drugim celem było zbadanie roli MATR3 i PSF w Rev-zależnym eksporcie transkryptów wirusa HIV-1. Uzyskano stabilną, nieindukowalną linię komórkową HEK 293T z wyciszonym białkiem MATR3, natomiast w przypadku konstruktu pLKO.1_shPSF nie udało się uzyskać stabilnej nieindukowalnej linii z wyciszonym białkiem PSF. Dlatego w przypadku tego konstruktu natychmiast po transdukcji cząstkami lentiwirusowymi na komórkach przeprowadzano dalsze eksperymenty. Uzyskana nieindukowalna linia z wyciszonym białkiem MATR3 oraz komórki z wyciszonym białkiem PSF zostały ko-transfekowane przy użyciu polietylenoiminy (PEI) wirusowymi konstruktami HIV-1 Gag p37 w obecności lub nieobecności wirusowego genu Rev. Konstrukty te kodują wirusowe białko p37 Gag, którego ekspresja zachodzi na drodze Rev-zależnej (konstrukt Gag p37-RRE) lub Rev-niezależnej (konstrukt Gag p37-CTE). Dodatkowo przetestowano konstrukty zawierające mutację w elementach niestabilności (konstrukty: Gag p37 M1-10 RRE i Gag p37 M1-10 CTE). Poprzez analizę Western Blotting wykazano, że wyciszenie MATR3 i PSF hamuje zarówno Rev-zależny oraz Rev-niezależny transport. Określenie mechanizmu działania MATR3 i PSF w czasie Rev-zależnego transportu wymaga dalszych badań.

The human immunodeficiency virus (HIV) is a lentivirus that belongs to the Retroviridae family. This human pathogen causes the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and is responsible of a devastating pandemic.HIV-1 gene expression is finely controlled by viral and cellular host factors. Generation of infectious HIV-1 requires the synthesis of two classes of HIV-1 transcripts: the spliced ones and the RRE (Rev Responsive Element)-containing unspliced/partially-spliced ones. The former are efficiently processed and rapidly exported to the cytoplasm, while the latter ones are retained in the nucleus due to the presence of instability sequences (INS). For effective export of these transcripts viral Rev protein is required. Various cellular factors have been reported to contribute to Rev activity, including nuclear matrix protein Matrin 3 (MATR3) and the polypyrimidine tract-binding protein associated splicing factor (PSF), but the nature of these interaction remains to be elucidated.In this work the role of MATR3 and PSF has been tested in Rev-dependent export of RRE/INS-containing transcripts. The first aim was to develop stable and IPTG inducible cell lines lacking expression of MATR3 and PSF (Jurkat_lacO_shM3, Jurkat_lacO_shPSF and Jurkat_lacO_shLuc) by lentiviral delivery of shRNA. The next aim of this work was to investigate the role of MATR3 and PSF in the Rev-dependent export. To achieve this, stable HEK293T cell line with depleted MATR3 were developed using uninducible shRNA lentiviral vectors. Unfortunately, it was not possible to develop HEK293T cell line depleted of PSF, so transient expression was used in that case. Resulting cells were co-transfected with HIV-1 Gag p37 viral clones with or without the Rev gene. These constructs encode Gag p37 protein, which expression is controlled by either Rev-dependent (construct Gag p37-RRE) or Rev-independent (construct Gag p37-CTE) mechanisms. Additionally, constructs carrying mutation in instability elements in Gag p37 (constructs: Gag p37 M1-10-RRE and Gag p37 M1-10-CTE) were tested. Western Blotting showed that depletion of either MATR3 or PSF inhibited Rev-dependent and also Rev-independent transcript export. Further studies are needed to tackle the specific role of MATR3 and PSF.