SLPI protein immunoprecipitation techniques as a tool for analysis of SLPI binding partners

Wydzielniczy inhibitor proteaz leukocytarnych (ang. Secretory Leukocyte Protease Inhibitor, SLPI), to białko produkowane przez wiele typów komórek, głównie w tych obszarach, które stanowią barierę przed środowiskiem zewnętrznym. Jego podstawową funkcją jest hamowanie proteaz serynowych, w tym elastazy neutrofilowej. Wykazano również, że posiada ono aktywność przeciwdrobnoustrojową. W kontekście odpowiedzi obronnej gospodarza SLPI odgrywa ważną rolę w kilku różnych obszarach. Jako czynnik przeciwdrobnoustrojowy, może stanowić pierwszą linię obrony przed infekcją. Kontroluje wytwarzanie mediatorów zapalnych i chroni gospodarza przed nadmiernym uszkodzeniem tkanki przez enzymy proteolityczne. Hamuje odpowiedź zapalną poprzez kontrolowanie aktywności czynnika transkrypcyjnego NFκB. Reguluje również produkcję i proimmunogenną funkcję zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (ang. neutrophil extracellular traps, NET). W prezentowanej pracy przedstawiono wyniki dotyczące optymalizacji metody detekcji rekombinowanego białka SLPI egzogennie dodanego do hodowli ludzkich neutrofili w celu potwierdzenia jego zdolności do przechodzenia ze środowiska zewnętrznego do wnętrza komórki, a w dalszym etapie detekcji potencjalnych cząsteczek, z którymi SLPI może wchodzić w interakcje po wniknięciu do komórek. Zastosowano trzy rodzaje technik precypitacji lub immunoprecypitacji: immunoprecypitację na złożu sefarozowym sprzęgniętym z przeciwciałem anty-HisTag, precypitację na złożu sefarozowym zawierającym jony niklu i immunoprecypitację na złożu agarozowym sprzęgniętym z białkiem A/G. Kluczową kwestią okazało się dobranie odpowiednich warunków prowadzenia inkubacji z danym złożem, w tym skład buforu, w którym prowadzono inkubację. Wykazano, że dodatek imidazolu zmniejsza liczbę niespecyficznych wiązań w przypadku detekcji SLPI z lizatów neutrofilowych na złożu sefarozowym zawierającym jony niklu, jednakże nie zwiększa wydajności wiązania SLPI. W przypadku izolacji na złożu agarozowym sprzęgniętym z białkiem A/G istotne okazały się dobór odpowiedniego przeciwciała wiążącego SLPI oraz czas trwania inkubacji z przeciwciałem i później ze złożem.Zoptymalizowanie detekcji białka SLPI w lizatach neutrofilowych daje potencjalną możliwość wykrywania jego interakcji z innymi białkami co może przyczynić się do lepszego zrozumienia procesów w które zaangażowane jest białko SLPI.

Secretory Leukocyte Protease Inhibitor (SLPI) is a protein produced by many types of cells, mainly in areas that are a barrier to the external environment. Its primary function is the inhibition of serine proteases, including neutrophil elastase. However, it has also been shown to have antimicrobial activity. In the context of the host's defensive response, SLPI plays an important role in several different areas. As an antimicrobial agent, it may be the first line of defense against infection. It controls the processing of inflammatory mediators and protects the host from excessive tissue damage by proteolytic enzymes and inhibits the inflammatory response by controlling the activity of the transcription factor NFκB. It also regulates the production and proimmunogenic function of neutrophil extracellular traps (NETs).This thesis presents the results of possible detection method for SLPI binding partners, using exogenous SLPI as a bite, to confirm that SLPI migrate from the external environment to the interior of the cell, and in further, to detect potential molecules which SLPI may interact after entering the cells. Three types of precipitation or immunoprecipitation techniques were used: immunoprecipitation on sepharose-beads conjugated with anti-HisTag antibody, nickel-binded sepharose precipitation and immunoprecipitation on agarose conjugated with A/G protein. The key issue has been the selection of appropriate incubation conditions for a given bed, including the composition of the incubation buffer. It has been shown that the addition of imidazole reduces the number of non-specific binding in the detection of SLPI from neutrophil lysates on the nickel -containing sepharose -beads, but does not increase the SLPI binding capacity. In the case of isolation on agarose conjugated with A/G protein, it was important to select the appropriate SLPI binding antibody and duration of incubation with antibody and later with beads. Optimizing detection of SLPI protein in neutrophil lysates gives potential ability to detection of its interactions with other proteins, which may contribute to a better understanding of the processes in which the SLPI protein is involved.