Expression of hK8 and hK14SA in the eukaryotic system LEXSY

Kalikreiny tkankowe obecne w płynach ustrojowych oraz gruczołach zewnątrzwydzielniczych stanowią ważną grupę enzymów proteolitycznych kluczowych w procesach sygnalizacji międzykomórkowej. Charakteryzują się dużym pokrewieństwem, a wiele z nich pełni znaczącą rolę w obiegu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Praca badawcza miała na celu ekspresję peptydaz z rodziny kalikrein: kalikreiny 8 oraz muteiny kalikreiny 14 w eukariotycznym systemie LEXSY, oczyszczenie uzyskanych proenzymów z wykorzystaniem metod chromatograficznych oraz aktywację prokalikreiny 8 enzymem aktywującym Kgp. Stosując eukariotyczny system ekspresyjny LEXSY uzyskano zarówno kalikreinę 8, jak i muteinę kalikreiny 14 w formach nie wykazujących aktywności biologicznej. Oba białka oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metalu. Dodatkowo do oczyszczenia kalikreiny 14 zastosowano metodę sączenia molekularnego. Otrzymane białka zostały pozbawione zanieczyszczeń oraz produktów pochodzących z degradacji. Prokalikreinę 8 aktywowano enzymem Kgp, uzyskując w ten sposób jej formę aktywną biologicznie. Kgp okazał się być efektywnym czynnikiem aktywującym kalikreiny, natomiast system ekspresyjny LEXSY bardzo dobrym narzędziem pozwalającym na otrzymanie proteaz należących do tej rodziny.

Tissue kallikreins occur in body fluids and exocrine glands. They are an important group of proteolytic enzymes involved in intracellular signaling processes. They are characterized by high affinities and many of them play an important role in the circulation of extracellular matrix proteins. Research work was aimed at expressing kallikrein peptidases: kallikrein 8 and kallikrein mutein 14 in the eukaryotic LEXSY system, purifying the proenzymes by chromatographic methods and activating prokallikrein 8 with Kgp activating enzyme. Using the eukaryotic LEXSY expression system, both kallikrein 8 and kallikrein mutein 14 were obtained in non-biologically active forms. Both proteins were purified by affinity chromatography to immobilized metal ions. Aditionally, size exclusion chromatography was used to the purification of kallikrein 14. Finally, proteins were devoided of impurities and degradation products. Prokallikrein 8 was activated with the Kgp enzyme, thus obtaining its biologically active form. Kgp has proven to be an effective activator of kallikreins, while the LEXSY expression system is a very good tool for obtaining proteases belonging to this family.