A comparative analysis of microscopy and PCR-based methods in detection of avian malaria parasites

Ptasie pasożyty krwi, w tym krwinkowce wywołujące tzw. “ptasią malarię”, to powszechny model w badaniach z zakresu biologii ewolucyjnej i ekologii, oraz użyteczny predykator w analizie dynamiki naturalnie występujących infekcji malarycznych u ludzi, szczególnie, w obliczu globalnych zmian klimatu. Współczesne badania coraz częściej zastępują tradycyjne, mikroskopowe techniki wykrywania pasożytów metodami molekularnymi, w większości opartymi o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Czułość i dokładność obu metod jest przedmiotem ożywionej dyskusji, tym bardziej, że dotychczasowe porównania nie doprowadziły do jednoznacznych konkluzji.Celem niniejszej pracy było określenie czułości metody molekularnej w porównaniu z tradycyjną obserwacją rozmazów krwi pod mikroskopem, oraz oszacowanie stopnia zapasożycenia i identyfikacja szczepów pasożytów z rzędu Haemosporida w materiale zebranym w populacji rokitniczki (Acrocephalus schoenobaenus) z Doliny Nidy (południowo-wschodnia Polska). Analizowano 442 próbki krwi pozyskane w latach 2004-2008. Wyniki analizy molekularnej porównano z rezultatami wcześniej przeprowadzonych obserwacji mikroskopowych.Wykazano, że zastosowana metoda molekularna charakteryzuję się wyższą czułością niż metoda mikroskopowa. W badanej populacji wykryto 7 szczepów pasożytów z rodzaju Haemoproteus i Plasmodium. Najczęściej występujące należą do gatunku Haemoproteus belopolskyi (niemal 95% zainfekowanych ptaków – szczepy SW1 (59,2% osobników) i SW3 (34,1% osobników). Jednocześnie, metoda molekularna zaniża częstość występowania infekcji powodowanych pasożytami z rodzaju Plasmodium, co może wynikać z ogólnych problemów występujących przy wykrywaniu infekcji mieszanych (pasożyty z rodzaju Plasmodium rzadko występowały w monorodzajowych infekcjach). Wykazano istotnie wyższe zapasożycenie samców, co może być powiązane ze zwiększonymi nakładami energetycznymi samców na początku sezonu lęgowego, kiedy pobierano materiał do badań.

Avian blood parasites, mainly haemosporidians causing avian malaria, are broadly used in evolutionary and ecological surveys. They also gain interest because of predictive value for dynamics of naturally occurring, human malarial infections, especially with regard to global climat change. Nowadays, molecular parasites detection techniques (almost entirely based on PCR), replace traditional blood films screening with light microscopy. As the metodology is crutial for every research, sensitivity and accuracy of both methods is still debated. So far, some comparisons between them have been made, but yet no conclusion was achieved. The aim of this study was to assess sensitivity and informative value of PCR based techniques in comparison to the microscopy, based on samples collected from intensively studied sedge warbler (Acrocephalus schoenobaenus) population from Nida valley, SE Poland. Blood samples used in this study were collected between 2004-2008 from 442 birds. Results were compared to previously performed microscopy screening.Applied molecular method proved to be more sensitive compared to microscopy. Molecular analysis revealed presence of 7 mitochondrial lineages of Plasmodium and Haemoproteus genera. The most prevalent species was Haemoproteus belopolskyi (almost 95% of infeceted individuals, lineages: SW1 - 59,2% of individuals, and SW3 - 34,1% of individuals). However, PCR underestimate prevalence of Plasmodium spp., which is most probably the result of general underestimation of mixed infections, as Plasmodium spp. was usually found as co-infecting species with Haemoproteus sp. There was a significant difference in parasites prevalence between sexes, males being more parasitised than females. This might have been caused by incerased investment of males in relation to mating, in the beginning of the breeding season, when the blood samples were collected.