Reporter system for human coronavirus NL63

Ludzki koronawirus NL63 (ang. human coronavirus NL63, HCoV-NL63) infekuje górne i dolne drogi oddechowe. U osób zdrowych wirus powoduje stosunkowo łagodne zakażenie, jednak może być niebezpieczny dla ludzi z osłabionym układem immunologicznym oraz dzieci i osób starszych powodując zakażenia dolnych dróg oddechowych oraz podgłośniowe zapalenie krtani u małych dzieci. Interesujący jest fakt, że wirus ten używa tego samego receptora (enzym konwertujący angiotensynę 2, ang. angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) do wnikania do komórek gospodarza co wirus SARS (zespół ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej, ang. Severe Acute Respiratory Syndrome). Wykrywanie zakażeń wirusowych, a następnie szybka i precyzyjna identyfikacja oraz kwantyfikacja aktywnych wirusów są priorytetami w przeciwdziałaniu ich rozprzestrzeniania się. Jedną z metod detekcji jest obserwacja efektu cytopatycznego na hodowlach komórkowych, aczkolwiek niesie ona za sobą kilka wad, takich jak subiektywność oceny, stosunkowo długi czas oczekiwania na pojawienie się zmian morfologicznych komórek od momentu infekcji oraz w niektórych przypadkach niespecyficzność względem rodzaju wirusa. Kolejnym problemem jest fakt, że izolaty kliniczne w dużej części nie replikują in vitro. Aktualnie najlepszą i najczęściej stosowaną metodą detekcji jest real-time PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy, ang. polymerase chain reaction), która opiera się na jednoczesnym namnażaniu i detekcji wirusowego materiału genetycznego i pozwala na jakościowe oraz ilościowe oznaczenie wirusa w próbce. Wskazuje na liczbę kopii wirusowego RNA lub DNA, jednakże nie daje informacji o liczbie zakaźnych, aktywnych wirionów.Celem niniejszej pracy było stworzenie fluorescencyjnego systemu reporterowego dla HCoV-NL63 opartego na permisywnej dla tego wirusa linii komórkowej LLC-MK2, który pozwoliłby na uproszczenie, skrócenie i zmniejszenie kosztów procesu wykrywania zakażenia tym wirusem. Dodatkowo, system taki pozwoliłby na szczegółową analizę procesu zakażenia na wczesnych etapach. Podstawą działania systemu było zastosowanie konstruktu genetycznego zawierającego gen reporterowy (białko zielonej fluorescencji, ang. green fluorescent protein, GFP) poprzedzony konserwatywną, wirusową sekwencją TRS (sekwencja regulująca transkrypcję, ang. transcription regulatory sequence), dzięki czemu mógłby ulegać ekspresji na wzór subgenomowego RNA (ang. subgenomic RNA, sgRNA).Utworzono dwa warianty kasety reporterowej: - pierwszy, zawierający kolejno od końca 5’: sekwencję wirusową identyczną do oryginalnej obejmującą tysiąc nukleotydów poprzedzających gen nukleokapsydu, N-TRS (sekwencja regulująca transkrypcję nukleokapsydu, ang. N-transcription regulatory sequence), trzydzieści nukleotydów odpowiadających dziesięciu pierwszym aminokwasom genu nukleokapsydu, GFP, identyczną do wirusowej sekwencję 3’UTR (obszar nieulegający translacji 3’, ang. 3' untranslated region)- drugi, wzbogacony o wirusową sekwencję 5’UTR (obszar nieulegający translacji 5’, ang. 5' untranslated region) identyczną do oryginalnej.Transfekcja żadnym z wyżej wymienionych RNA reporterowych nie pozwoliła na obserwację sygnału zielonej fluorescencji w komórkach zainfekowanych HCoV-NL63. Mimo to, wykryto obecność przewidywanej aktywnej formy reporterowego RNA w komórkach zakażonych LLC-MK2, co może świadczyć o funkcjonalności opracowanego systemu i zarazem o jego niskiej wydajności.

Human coronavirus NL63 (HCoV-NL63) infects upper and lower respiratory tract. Generally, in healthy individuals the symptoms of the diseases are relatively mild, but in immunosuppressed, elderly people and children it may cause life-threatening condition. Unusually for α-coronaviruses, HCoV-NL63’s spike protein interacts with angiotensin-converting enzyme 2, which appears to be the functional receptor for the pathogen. The only other coronavirus utilizing this cell receptor is SARS, β-coronavirus causing Severe Acute Respiratory Syndrome (Li, 2003 oraz van der Hoek, 2006). Viral detection and subsequent fast and precise identification and quantification of active viral particles are priorities towards prevention of their spread. Nowadays, the available in laboratories methods of coronaviruses detection and characterization are subjective, expensive, unspecific, insensitive or time-consuming. The best and the most often utilized method is real-time PCR (polymerase chain reaction), which allows the simultaneous amplification and detection of viral genetic material. Although it gives specific information both on the type of the virus and its total RNA or DNA amount, it doesn’t indicate how many of the viral particles are active.The main goal of this work was to create a fluorescent reporter system for human coronavirus NL63, which would facilitate and accelerate the process of HCoV-NL63 infection detection and would allow tacking of the virus infection process. The basis of its functionality was the construction of a reporter cassette, encoding green fluorescent protein (GFP gene) preceded by transcription regulatory sequence (TRS), which would allow the reporter to be expressed in the same way as viral subgenomic RNA.Two versions of the reporter cassette were obtained: - Construct that consisted of (starting from 5’ end): identical to viral, 1000 nucleotide sequence upstream of the nucleocapsid gene, N-TRS (nucleocapsid-TRS), 30 nucleotides corresponding to the 10 initial aminoacides of the nucleocapsid protein, GFP and region identical to viral 3’UTR (3' untranslated region)- Construct that was identical to the one described above, but contained at its 5’end the fragment identical to viral 5’UTR.Transfection of none of the above mentioned reporter versions allowed to observe green fluorescence in the HCoV-NL63 infected cells. Interestingly, it was proven that the predicted reporter sgRNA was formed in infected cells. This suggests that the developed system is fully functional, but the efficiency is very low.