The effect of cisplatin on the induction of apoptosis in cells with reduced level of RIPK4 kinase

Cisplatyna jako nieorganiczny związek chemiczny zawierający platynę jest lekiem, który dosyć powszechnie stosowany jest w chemioterapii nowotworów. Wykazano, że indukuje ona apoptozę poprzez tworzenie adduktów z kwasem nukleinowym, co jest przyczyną powstałych pęknięć w nici DNA, a co z tym idzie śmierci komórkowej. Najczęściej związek ten wykorzystywany jest w leczeniu: zaawansowanego raka pęcherza, raka piersi, a także czerniaka. Leczenie to przebiega jednak z różną skutecznością. Niedawno opisano, że kinaza RIPK4, która zaliczana jest do grupy treoninowo-serynowych kinaz białkowych, uwrażliwia komórki MG-63 na działanie ciplatyny. Z uwagi, że kinaza ta jest ważnym modulatorem apoptozy oraz regulatorem licznych ścieżek sygnałowych zaangażowanych w proliferację oraz różnicowanie komórek, w niniejszej pracy zbadano, czy komórki czerniaka z obniżonym poziomem białka RIPK4 są również bardziej wrażliwe na indukcję apoptozy przez cisplatynę. W tym celu obniżono poziom kinazy RIPK4 w komórkach WM266 za pomocą techniki siRNA. Następnie, wykorzystując techniki i metody takie jak: test MTT, barwienie AneksynąV/7AAD i cytometria przepływowa, test na aktywność kaspazy 3/7 (Caspase Glo 3/7) oraz Western Blot zbadano, czy komórki inkubowane przez 3-24 godzin z cisplatyną (10-50 μM) różnią się między populacją komórek z obniżonym poziomem kinazy RIPK4, a populacją komórek kontrolnych traktowanych niespecyficznym mRNA. W pracy wykazano, że obniżenie poziomu kinazy RIPK4 w komórkach WM266.4 traktowanych cisplatyną zwiększa: aktywację kaspazy 3/7, odsetek populacji komórek Annexin V+ oraz silniej obniża poziom ekspresji czynnika antyapoptotycznego Bcl-2 w stosunku do komórek kontrolnych, co świadczy o tym, że kinaza ta wpływa na proces apoptozy. Wykazano również, że obniżenie poziomu kinazy RIPK4 koreluje z obniżeniem poziomu ekspresji białka p53 i p21, co może wskazywać na zmniejszony proces naprawy, co należałoby zweryfikować.

Cisplatin is an inorganic chemical compound containing platinum that is a commonly used drug in cancer chemotherapy. It has been shown to induce apoptosis through the formation of nucleic acid adducts, which is the cause of the resulting DNA strand breaks, and thus cell death. Most often this compound is used in the treatment of advanced bladder cancer or breast cancer, as well as melanoma. Recently described RIPK4 kinase which belongs to the group of threonine-serine protein kinases was shown to increase sensitivity to cisplatin-induced apoptosis of MG-63 cells. Because this kinase is an important modulator of apoptosis and a regulator of numerous signal pathways involved in cell proliferation and differentiation, in this work we studied if cells with reduced RIPK4 protein levels are more sensitive to the induction of apoptosis by cisplatin. For this purpose, we lowered the level of RIPK4 kinase in WM266 cells using siRNA. Then, using techniques and methods such as MTT test, Annexin V/ 7ADD double staining and flow cytometry, Caspase Glo 3/7 activity test and Western Blot, we tested if cells treated for 3-24 hours with cisplatin (10-50 μM) differs between the population of cells with reduced RIPK4 kinase level and the population of control cells treated with non-specific mRNA The study showed that lowering the RIPK4 kinase level in WM266.4 cells treated with cisplatin increased activation of caspase 3/7 and the percentage of Annexin V + cell population, and inhibited the level of Bcl-2 antiapoptotic factor expression more efficiently compared to control cells. The results indicate that RIPK4 affects the process of apoptosis in melanoma cells. It has also been shown that a decrease of RIPK4 level correlates with a decrease of p53 and p21 protein that may indicate an impaired repair process,what should be verified.