The effect of liquiritigenin, isoliquiritigenin, flavokavain A and butein on the physiology as well as TGF-β1-stimulated epithelial-mesenhymal transition of human bronchial epithelial cell line BEAS-2B

Astma oskrzelowa jest heterogenną chorobą dróg oddechowych, dotykającą coraz większej części społeczeństwa. Charakteryzuje się występowaniem chronicznego stanu zapalnego związanego ze wzmożoną nadwrażliwością dróg oddechowych oraz przebudową ściany oskrzeli. Dotychczas istniejące metody leczenia astmy skupiają się na traktowaniu występujących objawów, jednakże nie są w stanie cofać zachodzących zmian zwłóknieniowych. Przebudowa ściany oskrzeli podczas astmy jest wieloczynnikowym procesem, jedną z jej składowych stanowi zaburzenie w funkcjonowaniu epitelialno-mezenchymalnej jednostki troficznej (EMTU) wynikające ze zmian zachodzących w fibroblastach oraz komórkach epitelialnych oskrzeli. Znaczącą rolę w progresji astmy pełni transformujący czynniki wzrostu-beta 1 (TGF-β1) – cytokina o zdolności do m.in indukcji fenotypowego przejścia fibroblastów oskrzelowych w miofibroblasty (FMT), a także procesu przejścia epitelialno-mezenchymalnego (EMT).W niniejszej pracy zaprezentowano wpływ czterech związków z rodziny flawonoidów, o potwierdzonym hamującym efekcie na proces FMT: likwirytygeniny (LIQ), izolikwirytygeniny (ISL), flawokawainy A (FKA) i buteiny (BUT) na fizjologię oraz stymulowane TGF-β1 przejście EMT ludzkich komórek nabłonka oskrzelowego linii BEAS-2B. Wykonane badania in vitro obejmowały analizę proliferacji, żywotności oraz ocenę zdolności komórek do migracji, a także wpływ badanych związków na ekspresję genów markerowych towarzyszących procesowi EMT.Wykazano, że LIQ, ISL oraz FKA cechują się niecytostatycznym, a także niecytotoksycznym efektem względem komórek BEAS-2B w następujących stężeniach: LIQ 10µM; ISL 2,5µM i FKA 10µM. Natomiast BUT w badanym zakresie stężeń (1-30 µM) jest cytotoksyczna dla badanych komórek, jednakże jej efekt w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli jest mniej intensywny, cechując się niecytotoksycznym efektem dla stężenia 10 µM. Zaprezentowano, w modelu zarastania rany, zdolność ISL i BUT do znacznego obniżania ruchliwości komórek BEAS-2B, z oraz bez stymulacji komórek TGF-β1. Wykazano, że część z badanych związków w niecytotoksycznych stężeniach cechowała się mniejszym (LIQ) lub większym (FKA, ISL) potencjałem do hamowania procesu EMT. Wyniki qPCR, po 24-godzinnej inkubacji komórek z badanymi związkami, wykazały obniżenie poziomu genów, towarzyszących indukowanemu TGF-β1 procesowi EMT w badanych komórkach: genu CDH2 (kodującego N-kadherynę) oraz genu FN1 (kodującego fibronektynę) - pod wpływem LIQ, ISL oraz FKA. Zauważono także wpływ LIQ, ISL, FKA oraz BUT na ekspresję genów czynników transkrypcyjnych SNAI1 i SNAI2, aktywnych podczas inicjacji procesu EMT. Zaskakująco wszystkie z badanych związków obniżały także ekspresję genu CDH1 (kodującego E-kadherynę) – popularnego markera fenotypu epitelialnego.Otrzymane wyniki wskazują na potencjał badanych związków do hamowania indukowanego TGF-β1 procesu EMT w komórkach BEAS-2B. Stanowią one jedynie wstęp do dalszych badań nad przeciwzwłóknieniowym właściwościami LIQ, ISL, FKA i BUT oraz potencjalnym zastosowaniu niniejszych związków w traktowaniu astmy oskrzelowej.

Bronchial asthma is a heterogeneous respiratory disease that affects an increasing part of society. It is characterised by chronic inflammation associated with airway hyperresponsiveness and remodelling of the airways. Current methods of treatment for asthma focus on alleviating disease symptoms, but are unable to reverse ongoing fibrotic changes in asthmatic airways. The remodelling of the bronchial airway is a multifactorial process, one of its components being the disfunction of the epithelial-mesenchymal topic unit (EMTU), caused by changes in fibroblast and bronchial epithelial cells. Transforming growth factor beta (TGF-β1) plays an important role in progression of asthma, this cytokine is capable of induction of the phenotypic fibroblast to myofibroblast transition (FMT), as well as epithelial to mesenchymal transition (EMT).This study presents the influence of 4 compounds from flavonoid family, with confirmed inhibitory effect on the FMT process: liquiritigenin (LIQ), isoliquiritigenin (ISL), flavokawain A (FKA) and butein (BUT) on physiology and TGF-β1 stimulated EMT of human bronchial epithelial cell line BEAS-2B. Experiments carried out in vitro included the analysis of cell proliferation, viability, and ability of cells to migrate, as well as the effects of the investigated compounds on changes in the expression of marker genes accompanying the EMT.LIQ, ISL and FKA have been shown to have noncytostatic and noncytotoxic effects on BEAS-2B cells at the following concentrations: LIQ 10µM; ISL 2,5µM and FKA 10µM. Whereas BUT in the tested concentration range (1-30 µM) is cytotoxic to the BEAS-2B cells. However, its effect during the first 24 hours of cell culture seems less intense, with a noncytotoxic effect of BUT at a concentration of 10 µM. The wound healing assay performed showed the ability of ISL and BUT to significantly decrease BEAS-2B cell motility with or without TGF-β1 stimulation. Some of the compounds tested in noncytotoxic concentrations has been shown to have lower (LIQ) or higher (FKA, ISL) potential to inhibit EMT. Data from qPCR analysis, after 24 hours of incubation of cells with the tested compounds, showed a decrease in the level of genes accompanying, the TGF-β1 induced EMT in BEAS-2B cells: the CDH2 gene (encoding N-cadherin) as well as the FN1 gene (encoding fibronectin) – under the influence of LIQ, ISL and FKA. Furthermore, LIQ, ISL, FKA, and BUT were shown to influence the expression of SNAI1 and SNAI2 genes that encode transcription factors, active during the initiation of EMT. Surprisingly, all of the testes compounds also had the ability to down-regulate the expression of CDH1 gene (encoding E-cadherin) – a popular marker of epithelial phenotype.The results obtained indicate the potential of the tested compounds to inhibit the TGF-β1 induced EMT in BEAS-2B cells. Collected data are only the beginning of further research on the antifibrotic properties of LIQ, ISL, FKS, and BUT as well as their potential use in the treatment of bronchial asthma.