NTERA-2 cell line as a model of human neurons in studies on molecular mechanism of action of antipsychotic drugs

Badania neurobiologiczne skupiające się na testowaniu działania leków wpływających na ośrodkowy układ nerwowy wciąż stanowią poważny problem dla współczesnych badaczy, w związku z brakiem odpowiedniego ludzkiego modelu eksperymentalnego. W poniższej pracy wykorzystano linię komórkową NTERA-2 (NT2/D1, cl1.) w celu poznania molekularnych mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych (klozapina, risperidon) stosowanych w leczeniu schizofrenii. W początkowym etapie eksperymentu przeprowadzono proces różnicowania komórek NT2 do neuronów (NT2-N), na podstawie procedury opracowanej przez Mofrada i wsp. [1], w którym wyróżnić można 3 etapy: 28-dniową hodowlę z kwasem retinowym, trypsynizację oraz 21-dniową hodowlę z inhibitorami mitotycznymi. W celu potwierdzenia prawidłowego przebiegu różnicowania po zakończeniu hodowli wykonano barwienia immunocytochemiczne na obecność markerów neuronalnych–MAP2 i synapsyny-1. W dalszym etapie zróżnicowane komórki NT2-N wykorzystane zostały jako model do testów leków przeciwpsychotycznych. Główny etap eksperymentu polegał na analizie proteomicznej mającej na celu zbadanie wpływu 72-godzinnej stymulacji lekami na proteom otrzymanych komórek nerwowych. Do realizacji tego zadania zastosowano opartą na spektrometrii mas ilościową metodę proteomiczną typu „shotgun”. Otrzymane wyniki analizowano w programie Mascot/Dicoverer, a także Andromeda/MaxQuant i Perseus. Białka regulowane przez leki (test ANOVA) istotnie wpływają na inicjowanie procesów przebudowy struktur komórkowych neuronów oraz wzrostu neurytów, a także są zaangażowane w procesy transportu synaptycznego. Ponadto, leki te hamują procesy degeneracji i apoptozy neuronów.

Neurobiological studies focusing on drugs targeted the central nervous system are still a serious problem for researchers, because of the lack of appropriate human cells model. In this study NTERA-2 (NT2/D1, cl1.) cell line was used to elucidate a molecular mechanism of action of antipsychotic drugs. These drugs (clozapine, risperidone) are commonly used in schizophrenic patients’ therapy. In the first part of the project, the differentiation of NT2 cells was conducted according to a procedure described by Mofrad et al. [1]. The protocol is divided into three stages: 4-weeks retinoic acid treatment, double trypsinization, and further cell culturing with mitotic inhibitors. After 7 weeks lasting differentiation process, an immunocytochemistry staining was performed to confirm the presence of neuron-specific markers such as MAP2 and synapsin-1. Then, obtained neurons were used as a model for antipsychotic (clozapine and risperidone) studies. The main aim of the study was proteomics analysis of the impact of 72h antipsychotic treatment on NT2-N derived neuron protein profile. For this purpose, a shotgun label-free mass spectrometry-based technique was used. The results were analyzed using Mascot/Discoverer, Andromeda/MaxQuant and Perseus software. Regulated by drugs, differential proteins which fulfilled the ANOVA test has an impact on rebuilding cell structure and neurite outgrowth and also the regulation of synaptic vesicle transport. Furthermore, both drugs inhibit the degeneration process and apoptosis of neurons.