Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells and hiPSC-derived cardiomyocytes lacking microRNA-378a

Kardiomiocyty uzyskane przez różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CM) znalazły zastosowanie w eksperymentalnej medycynie regeneracyjnej, testowaniu leków oraz modelowaniu różnych chorób. Jednak ze względu na ich fenotyp przypominający kardiomiocyty płodowe nie mogą być modelem oddającym warunki kardiomiocytów występujących w dorosłym sercu, co znacząco ogranicza ich potencjał. Jak dotąd nie poznano ścieżek rozwojowych kierujących procesem dojrzewania kardiomiocytów zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Jednak, coraz więcej prac wskazuje, że jednym z czynników niezbędnych w procesie dojrzewania hiPSC-CM, jest wprowadzenie kwasów tłuszczowych do pożywki hodowlanej. Teza ta ma odzwierciedlenie w procesach zachodzących przed oraz po narodzinach. Wraz z większą dostępnością tlenu oraz kwasów tłuszczowych dochodzi do zmiany metabolizmu kardiomiocytów z glikolizy na β-oksydację kwasów tłuszczowych. Towarzyszą temu liczne zmiany strukturalne i funkcjonalne kardiomiocytów. Jednym z mikroRNA (miRNA), którego ekspresja znacząco wzrasta po narodzinach a także podczas długoterminowej hodowli hiPSC-CM jest miR-378a. Jak dotąd, jego rola w kardiomiocytach nie została dobrze poznana. Zaangażowany jest on w procesy związane z metabolizmem kwasów tłuszczowych. Reguluje ekspresję IGF, IGF1R oraz kinaz uczestniczących w przekazie sygnału komórkowego m.in reagującego na wzrost hipertroficzny kardiomiocytów. Wykonane w poniższej pracy badania wskazują na zaangażowanie miR-378a w regulację procesów związanych zarówno z metabolizmu hiPSC-CM jak i ich wzrostem hipertroficznym. Zaobserwowano, że komórki z delecją miR-378a po wprowadzeniu pożywki z kwasami tłuszczowymi wykazują wzrost ekspresji IGF1R, zarówno na poziomie białka jak i mRNA, co w połączeniu ze spadkiem fosforylacji kinazy Erk i wzrostem ekspresji p21 prowadzi do senescencji i wzrostu hipertroficznego. Dodatkowo, po podaniu pożywki zawierającej kwasy tłuszczowe zaobserwowano spadek ilości mitochondriów oraz wzrost ekspresji podjednostek enzymów łańcucha oddechowego. Obniżeniu uległa ekspresja PPARα zaangażowanego w regulację metabolizmu kwasów tłuszczowych, co mogło wpłynąć na pobranie kwasu palmitynowego z pożywki i ochronę hiPSC-CM miR-378aKO przed efektem cytotoksycznym. Brak miR-378a w badanych komórkach przyczynił się do zwiększonej hipertrofii charakterystycznej dla dojrzewających kardiomiocytów. Jednak, obniżona ilość mitochondriów, spadek aktywności błon mitochondrialnych oraz niższy stosunek izoform tityny N2B/ N2BA świadczy o ich charakterze płodowym. Wyniki wskazują na zaangażowanie miR-378a w procesy łączące zmiany metaboliczne wynikające z obecności kwasów tłuszczowych w pożywce hodowlanej ze wzrostem hipertroficznym oraz regulacją zmian ekspresji genów związanych z procesem dojrzewania.

Cardiomyocytes derived from hiPSC (hiPSC-CM) are potent tool for drug screening, cardiac development and disease modelling and are tested in regenerative approaches. However, their phenotype is similar to fetal cardiomyocytes which can limit their potential in regenerative medicine and new drugs testing. Process of cardiomyocytes maturation both in in vivo and in vitro has not be understood so far. It is highly probable that this process is induced by higher fatty acids availability after a birth. In in vitro experiments it was noticed that applying fatty acid into culture medium improves maturation of hiPSC-CM. Nevertheless, pathways which drives this process has not been investigated. miR-378a is one of the most highly expressed microRNAs in heart. Its expression increases with life time and in long term hiPSC-CM culture. What is more, it is expressed only in cardiomyocytes and not in any other cells in heart. miR-378a is involved in hypertrophic growth via regulation of IGF1R and MAPK kinases pathways and in regulation of metabolism. Despite all of those functions, role of miR-378a in the heart has not been well investigated so far. Generated isogenic hiPSC miR-378a lines did not show differences in pluripotency markers expression or in ability to differentiate into cells derived from all three germ layers. Cardiac differentiation efficiency was more than 85% in all hiPSC-CM miR-378aKO lines and controls. Hypertrophic growth is promoted in miR-378a-deficient cardiomyocytes in media containing either glucose (GLCM) or palmitic acid (FAM) as an energy source. Titin N2B/ Titin N2BA ratio is decreased in hiPSC-CM miR-378aKO in GLCM and FAM. The mitochondrial content and mitochondrial membrane activity are decreased in hiPSC-CM FAM in comparison to control. These Data show that hiPSC-CM miR-378a are less mature than control ones, which suggests that miR-378a connects cardiac metabolism and hypertrophic growth during maturation process.