Analysis of fatty acids in a model of metastatic breast cancer in mice

Celem niniejszej pracy było opracowanie metody jednoczesnego oznaczania trzydziestu sześciu wybranych kwasów tłuszczowych przy użyciu ultrasprawnego chromatografu cieczowego sprzężonego z tandemowym spektrometrem mas z potrójnym kwadrupolem, wykorzystując elektrorozpylanie w jonizacji ujemnej. Przedmiotem analizy było czternaście nasyconych, jedenaście jednonienasyconych oraz jedenaście wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Jako metodę oczyszczania próbek biologicznych zastosowano ekstrakcję w układzie ciecz-ciecz z odparowaniem rozpuszczalnika organicznego do sucha w atmosferze azotu. Dokonano optymalizacji parametrów detekcji masowej i warunków rozdzielenia chromatograficznego. Jako fazę ruchomą zastosowano dwa układy: 1) ultraczystą wodę i acetonitryl oraz 2) octanu amonu w wodzie i acetonitryl. Rozdzielenie chromatograficzne oznaczanych kwasów tłuszczowych wykonano w elucji gradientowej na kolumnie ACQUITY UPLC BEH C18 (130Å, 1,7 μm, 2.1 x 50 mm). Czasy retencji kwasów tłuszczowych mieściły się odpowiednio w zakresie od 2,94 do 3,55 minuty oraz od 3,00 do 3,49 minuty dla 1 oraz 2 fazy. Do oceny liniowości metody zastosowano chlorowodorek labetalolu jako standard wewnętrzny, octan etylu z dodatkiem kwasu octowego jako odczynnik w procesie ekstrakcji próbki oraz sztuczne osocze jako matrycę. Krzywe kalibracyjne wyznaczono dla 23 kwasów tłuszczowych. Z wyjątkiem kwasu eikozapentaenowego zakres liniowości dla próbek oznaczanych na fazie 1 wynosił 0,01-5 μg/mL, natomiast dla próbek oznaczanych na fazie 2 - 0,1-5 μg/mL. Współczynnik korelacji mieścił się w granicach 0,9909-0,9999 w przypadku fazy z dodatkiem octanu amonu oraz 0,9879-0,9995 dla fazy ruchomej bez dodatku modyfikatora.

The aim of this study was to develop a method for the simultaneous determination of thirty-six selected fatty acids with an ultra-efficient liquid chromatograph coupled with a triple quadrupole tandem mass spectrometer, using electrospray in negative ionization. The subject of the analysis were fourteen saturated, eleven monounsaturated and eleven polyunsaturated fatty acids. A liquid-liquid extraction with evaporation of the organic solvent to dryness under nitrogen atmosphere was used as a method of purifying biological samples. Mass detection parameters and chromatographic separation conditions were optimized. Two mixtures: 1) ultrapure water and acetonitrile and 2) ammonium acetate in water and acetonitrile were used as the mobile phase. Chromatographic separation of the determined fatty acids was performed by gradient elution on an ACQUITY UPLC BEH C18 column (130Å, 1.7 µm, 2.1 x 50 mm). Fatty acid retention times ranged from 2.94 to 3.55 minutes and from 3.00 to 3.49 minutes for phases 1 and 2, respectively. To assess the linearity of the method, labetalol hydrochloride was used as an internal standard, ethyl acetate with the addition of acetic acid as an organic solvent in the extraction process and artificial plasma as a matrix. Calibration curves were plotted for 23 fatty acids. With the exception of eicosapentaenoic acid, the determined range of linearity for samples tested in phase 1 was 0.1-5 μg/mL, while for samples measured in phase 2 it was 0.1-5 μg/mL. The calculated correlation coefficient was in the range of 0.9909-0.9999 for ammonium acetate and 0.9879-0.9995 for mobile phase without modifier.