Influence of the biodegradable polymers releasing plant-derived, active substances on the condition of periodontal cells

Naturalne polimery, takie jak polisacharydy, zyskują coraz to większe zainteresowanie ze względu na ich biodegradowalność, małą toksyczność, niewielki koszt i łatwą dostępność. Guma gellan jest polisacharydem wytwarzanym przez bakterię Sphingomonas elodea, który znalazł zastosowanie w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i inżynierii tkankowej. Ponieważ substancje aktywne z korzeni Pelargonium sidoides wykazały działanie przeciwbakteryjne, przeciwnowotworowe i przeciwzapalne, ekstrakt z korzenia (PSRE) i wyizolowana frakcja proantocyjanidyn (PCAN) zostały zmieszane z gumą gellan i usieciowane w obecności EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid) lub CaCl2 w celu uzyskania trójwymiarowej struktury hydrożelu.Celem niniejszej pracy było określenie wpływu biodegradowalnych hydrożeli na bazie gumy gellan na kondycję pierwotnych komórek pochodzenia zębowego. Hydrożele w postaci nośników substancji aktywnych z P. sidoides, mają degradować, uwalniać substancje i wspomagać leczenie ognisk zapalnych spowodowanych paradontozą.Cytotoksyczność biokomponentów badano in vitro wykorzystując modele komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC) i więzadła okołozębowego (PDLSC). Komórki hodowano w 24-dołkowych płytkach w pożywce zawierającej surowicę (SCM), a następnie traktowano przez 24 godziny pożywkami SCM pochodzącymi z czystych hydrożeli (referencja), hydrożeli zawierających 30% PSRE lub 20% PCAN oraz świeżym SCM bez kontaktu z hydrożelami (kontrola). Powyższe hydrożele testowano w formie sieciowanej CaCl2 lub EDC, a także w dwóch różnych strukturach – jako duże rusztowania oraz niewielkie listki przeznaczone do badań klinicznych. Oceny żywotności komórek dokonano przy użyciu testu MTS a otrzymane wyniki wskazują na istotne zahamowanie proliferacji komórek DPSC i PDLSC utrzymywanych w pożywkach zawierających produkty rozpadu hydrożeli wraz z PSRE lub PCAN w porównaniu do kontroli. Produkty rozpadu czystych hydrożeli były nietoksyczne dla obu typów komórek. Jednak analiza cytotoksyczności próbek hydrożeli przeznaczonych do badań klinicznych wykazała brak cytotoksycznego ich wpływu na kondycję komórek zębowych zarówno czystych hydrożeli, jak i tych zawierających substancje aktywne z P. sidoides. Co więcej, obecne w pożywce produkty rozpadu czystych hydrożeli sieciowanych EDC stymulowały oba typy komórek do tworzenia cytoplazmatycznych pęcherzyków. Weryfikując hipotezę o autofagicznym pochodzeniu pęcherzyków, zastosowano barwienie komórek oranżem akrydyny (OA) i LysoTracker, potwierdzając wzrost liczebności kwaśnych organelli pęcherzykowych w komórkach a następnie metodą Western Blot wykazano znaczny wzrost przemiany białka-znacznika autofagii z formy LC3-I do LC3-II w obu typach komórek. Ostatecznie, obserwacja transmisyjną mikroskopią elektronową ultrastruktury DPSC i PDLSC traktowanych pożywkami z hydrożelami sieciowanymi EDC potwierdziła obecność autofagosomów zawierających organelle komórkowe i komponenty cytoplazmatyczne otoczone podwójną błoną.Otrzymane wyniki wykazują, że hydrożele na bazie gumy gellan mogą być z powodzeniem stosowane w regeneracji tkanek przyzębia, chociaż hydrożele usieciowane EDC mogą stymulować proces autofagii w zębowych komórkach pierwotnych.

Natural polymers, such as polysaccharides, have become increasingly important because of their biodegradability, low toxicity, low cost and high availability. Gellan Gum is an extracellular polysaccharide produced by the bacterium Sphingomonas elodea, and was found useful in food processing, pharmaceutical industries, and tissue engineering. Since active substances from Pelargonium sidoides roots have shown antibacterial, anticancer and anti-inflammatory activities, a root extract (PSRE) and isolated fraction of proanthocyanidins (PCAN) were mixed with Gellan Gum, and cross-linked in the presence of EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) or CaCl2 to obtain three-dimensional structure of hydrogels.The aim of the study was to assess an influence of biodegradable Gellan Gum-based hydrogels on viability of primary tooth-derived cells. Hydrogels as the carriers of active substances from P. sidoides should degrade, release substances, and decrease inflammatory response at the periodontal sites.Cytotoxicity of the biocompounds was tested in vitro using both Dental Pulp Stem Cells (DPSC) and Periodontal Ligament Stem Cells (PDLSC) as the models. The cells were cultured in 24-well plates in Serum Containing Medium (SCM) and then treated for 24 hours with SCM derived from pure hydrogels (reference), those loaded with P. sidoides active substances 30% PSRE or 20% PCAN, and fresh SCM without contact with hydrogels (Control). The tests were performed for hydrogels cross-linked with either CaCl2 or EDC in two different forms – big scaffolds or small chips dedicated further to clinical studies. Cell viability/proliferation was examined by MTS assay and the results indicated that in relation to the control group, the biopolymers significantly impair DPSC and PDLSC viabilities when treated with hydrogels mixed with PSREs and PCANs. However, the reference hydrogels were non-toxic for both types of cells. Nevertheless, both hydrogel samples in the pure form and the form loaded with P. sidoides active substances prepared for clinical trials did not revealed cytotoxic effects on tooth-derived stem cells. Moreover, the cells treated with degradation products of Gellan Gum cross-linked with EDC have shown increased number of intracellular vesicles. To verify the hypothesis about autophagic origin of the vesicles, Acridine Orange (AO) and LysoTracker staining of the cells was used. It confirmed increased number of acidic vesicular bodies. Further, on the basis of Western Blot analysis of autophagy marker - LC3 protein, intensive conversion of LC3-I to LC3-II form was noted in both types of the cells. Finally, the analysis of ultrastructure of DPSCs and PDLSCs by means of transition electron microscopy confirmed the presence of organelles and cytoplasmic components in double-membrane vesicles when the cells were treated with the hydrogels cross-linked with EDC. The results indicate that Gellan Gum-based hydrogels can be successfully utilized in regeneration of periodontal tissues, although the hydrogels cross-linked with EDC might induce autophagy in tooth-derived stem cells.