Influence of selected anabolic steroids on the balance between mitophagy and mitochondrial biogenesis during in vitro maturation of porcine oocytes

Środowiskowe związki o aktywności endokrynnej (EACs), ze względu na udokumentowany, niekorzystny wpływ na funkcjonowanie organizmów zwierząt i ludzi, są coraz częstszym obiektem interdyscyplinarnych badań. Szereg przedstawicieli tych związków ma możliwość przyłączania się do swoistych receptorów endogennych hormonów zakłócając tym samym działanie szeregu gruczołów dokrewnych oraz zaburzając gospodarkę hormonalną organizmów. Występujące w środowisku zanieczyszczenia, stosowanie pestycydów i fungicydów w rolnictwie, korzystanie ze sterydów anabolicznych oraz leków terapii hormonalnej to częste przyczyny niekorzystnego oddziaływania EACs na organizmy. W związku z tym, niniejsza praca magisterska miała na celu zbadanie czy wybrane EACs: winklozolina (Vnz) – dosyć powszechnie stosowany w rolnictwie fungicyd, androgenny steryd anaboliczny – nandrolon (Ndn) oraz immunosupresyjna cyklosporyna A (CsA), wykazują wpływ na równowagę pomiędzy mitofagią i biogenezą mitochondriów w oocytach świni, tym samym wpływając na ich kompetencje rozwojowe podczas procedury dojrzewania in vitro (IVM) z wykorzystaniem hodowli 3D całych kompleksów oocyt-komórki wzgórka (COCs).Celem zbadania czy wybrane EACs mają wpływ na proces autofagii dokonano ilościowej analizy ekspresji mRNA genu LC3. W celu zobrazowania rozmieszczenia mitochondriów (mt) w komórkach wzgórka wykorzystano barwienie immunofluorescencyjne MitoTracker Orange (MtOR). Przeprowadzono również analizę ultrastruktury mt z wykorzystaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Ostatnim zadaniem badawczym było zobrazowanie procesu mitofagii w COCs, z wykorzystaniem Mitophagy Detection Kit®. Otrzymane wyniki wykazały, że CsA indukowała mitofagię w komórkach wzgórka (CC), zakłócając metabolizm oocytów i osłabiając ich jakość. Świadczy o tym również zwiększony poziom mRNA dla LC3 i obecność licznych autofagosomów w cytoplazmie oocytów. W przypadku pozostałych związków: Vnz i Ndn, nie zaobserwowano indukcji procesu mitofagii. Analiza immunofluoresencyjna rozmieszczenia i aktywności mitochondriów pokazała, że w obecności zarówno Vnz jak i CsA, mt emitują intensywny sygnał, czego nie stwierdzono w przypadku COCs hodowanych z dodatkiem Ndn co może świadczyć o ich niższej aktywności.Podsumowując uzyskane wyniki można stwierdzić, że długotrwałe stosowanie zarówno CsA jak Ndn może zaburzać metabolizm oocytów, w konsekwencji doprowadzając do obniżenia ich jakości. Zatem niekontrolowane zażywanie sterydów anabolicznych czy też długotrwałe terapie z wykorzystaniem immunosupresantów mogą obniżać szanse na zajście oraz utrzymanie ciąży, a także powodować niższe wskaźniki sukcesu w wykorzystaniu technik wspomaganego rozrodu.

Environmental compounds with endocrine activity (EACs), due to their documented adverse effect on the functioning of animal and human organisms, are an increasingly frequent subject of interdisciplinary research. A number of representatives of these compounds have the ability to attach to specific receptors of endogenous hormones, thus interfering with the function of a number of endocrine glands and disrupting the hormonal balance of organisms. Pollution in the environment, the use of pesticides and fungicides in agriculture, the use of anabolic steroids and hormone therapy drugs are common causes of the adverse effects of EACs on organisms. Therefore, this master's thesis was aimed at examining whether selected EACs: vinclozolin (Vnz) - a fungicide quite commonly used in agriculture, androgenic anabolic steroid- nandrolone (Ndn) and immunosuppressive cyclosporine A (CsA), show an effect on the balance between mitophagy and biogenesis of mitochondria in porcine oocytes, thus influencing their developmental competences during the in vitro maturation procedure (IVM) using 3D culture of whole oocyte-cumulus cell complexes (COCs).In order to investigate whether selected EACs affect the process of autophagy, a quantitative analysis of mRNA expression of the LC3 gene was performed. MitoTracker Orange (MtOR) immunofluorescence staining was used to visualize the distribution of mitochondria (mt) in cumulus cells. Ultrastructure analysis of mt was also performed using a transmission electron microscope (TEM). The last research task was to visualize the process of mitophagy in COCs, using the Mitophagy Detection Kit®.The obtained results clearly showed that CsA induced mitophagy in cumulus (CC) cells, disrupting oocyte metabolism and impairing their quality. This is also evidenced by the increased mRNA level for LC3 and the presence of numerous autophagosomes in the oocyte cytoplasm. In the case of the remaining compounds: Vnz and Ndn, mitophagy induction was not observed. Immunofluorescence analysis of the distribution and activity of mitochondria showed that in the presence of both Vnz and CsA mt emit an intense signal, which was not found in the case of COCs cultured with the addition of Ndn, which may indicate their lower activity.Summing up the obtained results, it can be concluded that long-term use of both CsA and Ndn may disturb the metabolism of oocytes, consequently leading to a decrease in their quality. Therefore, uncontrolled use of anabolic steroids or long-term therapies with the use of immunosuppressants may reduce the chances of getting pregnant and maintaining pregnancy, as well as cause lower success rates in the use of assisted reproductive techniques.