Badanie wpływu dopaminy na edycję RNA w mózgu Drosophila melanogaster

Edycja RNA jest stosunkowo nowym i słabo poznanym typem modyfikacji RNA, wpływającym na strukturę pierwszorzędową RNA. Najbardziej rozpowszechniony typ edycji RNA, występujący pośród wszystkich organizmów wielokomórkowych, to edycja adeniny do inozyny, zachodząca przy udziale enzymów z rodziny Adenosine Deaminases Acting on RNA (ADAR). Wykazano, że edycja RNA jest niezbędna dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu. Zmiany w edycji RNA zostały powiązane z wieloma zaburzeniami psychicznymi oraz chorobami neurodegeneracyjnymi takimi jak autyzm, depresja, schizofrenia oraz choroba Alzhaimera. Dopamina jest ważnym neuroprzekaźnikiem, a jej brak w mózgu, może potencjalnie wpływać na edycję RNA.By zbadać tą zależność, użyto porównawczego sekwencjonowania genomów oraz RNA-Seg Illumina do wykrycia potencjalnych zmiany we wzorze edycji RNA zależnych od dopaminy w mózgu Drosophila melanogaster. Wykorzystano przy tym nowy genotyp muchy, który nie syntetyzuje dopaminy w centralnym układzie nerwowym opracowany przez Karola Cichewicza. Otrzymane wyniki wykazały, że wzorzec edycji jest stały w obrębie jednego genotypu i co ważniejsze wykazano, że tło genetyczne jest jednym z ważniejszych czynników regulujących edycję RNA. Spośród 3273 opisanych wcześniej, oraz 2298 nowo odkrytych przeze mnie potencjalnych miejsc edycji RNA, 39 wykazało zmiany w edycji korelujące z poziomem dopaminy. Kontrolne sekwencjonowanie Sangera wyeliminowało jednak większość z kandydatów, wykrywając mutacje, polimorfizmy oraz błędy w mapowaniu sekwencji w miejscach wcześniej wykrytej różnicowej edycji RNA. Potwierdzono dwa miejsca różnicowej edycji RNA odpowiadające na obecność dopaminy w mózgu. Miejsce edycji w obszarze kodującym gen Calx wykazywało wysoki poziom edycji przy braku dopaminy, a miejsce edycji RNA w intronie CG34110 było częściej edytowane w genotypach z normalnym poziomem dopaminy w mózgu. Obserwacje te nie zostały potwierdzone przez farmakologiczne zmiany poziomu dopaminy w mózgu much. Ponadto dalsze badania genetyczne sugerują brak powiązania pomiędzy poziomem dopaminy a edycją RNA, wskazując na obecność dodatkowego czynnika regulującego, powiązanego genetycznie z chromosomem zawierającym transgeny odpowiedzialne za brak dopaminy w centralnym układzie nerwowym.

RNA editing is a relatively new and less known type of RNA modification conserved across all metazoans, that alters primary sequence of RNA. The most prevalent adenosine to inosine RNA editing, mediated by enzymes from Adenosine Deaminases Acting on RNA (ADAR) family, is necessary for brain development and function. Altered RNA editing is associated with many neurodegenerative and mental disorders such as Alzheimer's disease, autism, major depressive disorder, and schizophrenia. The absence of dopamine, an important neurotransmitter, could potentially affect RNA editing in the central nervous system.To examine this possibility, I used genomic and RNA-Seq Illumina sequencing to identify sites differentially edited in the brain in the absence of dopamine, and a brain dopamine-deficient Drosophila model developed in our lab by Karol Cichewicz. My results show that the RNA editing pattern is consistent across all samples from a given genotype and moreover, that genetic background is one of the main factors modulating ADAR activity. Amongst 3273 previously described and 2298 de novo discovered RNA editing sites, 39 candidates show differential editing as a function of dopamine. Sanger sequencing eliminated the most of the candidates initially misidentified in RNA-Seq data due to polymorphisms or misalignment errors. I validated two sites with significant change associated with absence/presence of dopamine. One highly edited site in the absence of brain dopamine in the Calx coding region, and a highly edited site only in the dopamine proficient genotypes in the CG31140 intron. I was unable to confirm either change by pharmacological manipulation of dopamine levels. Moreover, further genetic studies indicate lack of correlation with dopamine presence on RNA editing suggesting the existence of an additional RNA editing regulatory element genetically tracking with a chromosome containing transgenes responsible for dopamine-deficiency.