Effects of 5'-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) on immunological parametrs of macrophages

5’-bromo-2’-deoksyurydyna (BrdU) jest markerem proliferacyjnym komórek, ze względu na fakt, że przyłącza się w do DNA w miejsce wiązania tymidyny - jako jej analog – w fazie S cyklu komórkowego. Inkorporcja BrdU może się jednak wiązać ze skutkami ubocznymi, np. mutacjami i zmianami konformacyjnymi chromatyny, prowadząc w konsekwencji do zmian fizjologii komórki. Makrofagi linii komórkowej RAW 264.7 są silnie profilerującymi leukocytami, które są często wykorzystywane w badaniach in vitro makrofagów. Dotychczas nie przeprowadzono szczegółowej analizy wpływu BrdU na fizjologię tych komórek. Dlatego celem niniejszej pracy było zweryfikowanie hipotezy badawczej, postulującej, że BrdU wpływa na wybrane parametry fizjologiczne i immunologiczne makrofagów linii komórkowej RAW 264.7. W badaniach testowano spoczynkowe makrofagi oraz komórki aktywowane immunologicznie poprzez stymulację lipopolisacharydem (LPS). Do obu typów komórek dodawano BrdU a następnie wykonywano testy, w tym analizę immunocytochemiczną inkorporacji BrdU, sprawdzając sukces jego wbudowania do DNA. Ponadto sprawdzono przyleganie komórek do podłoża (test pośrednio szacujący żywotność makrofagów) przy pomocy testu z fioletem krystalicznym (CV), ich aktywność mitochondrialną (test MTT) i produkcję tlenku azotu (NO) przy użyciu testu Griessa. Wykazano, że BrdU nie wpływa na przyleganie komórek do podłoża, a zatem także ich przeżywalność oraz produkcję NO, natomiast zwiększa aktywność mitochondrialną. Podobne wyniki obserwowano gdy komórki były równocześnie eksponowane na działanie BrdU i LPS. Sam LPS obniżał żywotność makrofagów oraz pobudzał je do produkcji i wydzielania NO. Zatem ponieważ komórki odpowiedziały na kontrolę pozytywną zgodnie z danymi literaturowymi, uwiarygadnia to wyniki uzyskane w przypadku BrdU. Podsumowując, BrdU wpływa tylko nieznacznie na badane parametry fizjologiczne i immunologiczne makrofagów, nie powodując zmian w fizjologii tych komórek i może być wykorzystywany w badaniach na makrofagach linii komórkowej RAW 264.7 jako marker proliferacyjny.

5'-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) is a cell proliferation marker as it binds to DNA, serving as the thymidine analogue, during the S-phase of the cell cycle. However, BrdU incorporation may cause side effects such as chromatin mutations and its conformational changes eventually altering the cell physiology. Macrophages of the RAW 264. 7 cell line are highly proliferative leukocytes that are commonly used in in vitro macrophage studies. Thus far no detailed analyses of the impact of BrdU on the physiology of these cells have been performed. The aim of the present work was therefore to test a hypothesis that BrdU influences selected physiological and immunological parameters of the RAW 264.7 macrophages. In the studies, both resting inactive macrophages were tested as well as cells immunologically activated with lipopolysaccharide (LPS). Both cell types were treated with BrdU and numerous tests were then performed, including immunocytochemical analyses of BrdU incorporation to verify the success of its embedding into DNA. In addition, cell adhesion (indirectly estimating macrophage viability) was tested by a crystal violet assay (CV) and furthermore, mitochondrial activity (MTT) and nitrogen monoxide production (NO; the Griess test) were evaluated. BrdU did not influence cell adhesion/macrophage survival nor NO production but it increased mitochondrial activity of the cells. Similar results were observed when the cells were exposed to BrdU and LPS at the same time. LPS itself reduced the viability of macrophages and it stimulated them to produce and secrete NO. As the cells responded to the positive control as expected and according to literature, this validated the BrdU results. In summary, BrdU has only a minor impact on the studied physiological and immunological parameters of macrophages, and as it is not changing the physiology of these cells, it can be used as a proliferation marker in studies on RAW 264.7 macrophages.