Visualization of HSP90 in human macrophages using a fluorescent-labeled inhibitor

Makrofagi jako komórki układu odpornościowego stanowią jedną z pierwszych linii obrony organizmu. Obecność w ich błonach dużej ilości receptorów sprawia, że komórki te są zdolne do rozpoznawania różnorodnych wzorców molekularnych mogących pochodzić zarówno od mikroorganizmów infekcyjnych (PAMPs), jak i uszkodzonych komórek gospodarza (ACAMPs oraz DAMPs). W skład kompleksów rozpoznających wzorce molekularne poza wymienionymi receptorami mogą wchodzić też różnorodne białka im towarzyszące. Ostatnie badania dowiodły, że do receptora TLR4 wskutek rozpoznania lipopolisacharydu (LPS) dokują białka HSP70 i HSP90. Istnieją również doniesienia o hamującym wpływie selektywnych inhibitorów HSP90 na produkcję prozapalnych cytokin takich jak IL-1, IL-6, oraz TNF w ludzkich makrofagach po stymulacji LPS oraz Taxolem. Z wymienionych powodów badania białka HSP90 stanowią szczególny przedmiot zainteresowania dzisiejszej biologii molekularnej.Celem niniejszej pracy była wizualizacja białka HSP90 w ludzkich makrofagach przy pomocy specyficznego inhibitora - geldanamycyny skoniugowanej z FITC. Przy użyciu analiz mikroskopowych planowano określić optymalne stężenie inhibitora, a także zbadać kinetykę jego wiązania do HSP90 obecnych w błonie komórkowej makrofagów. Planowano również sprawdzić potencjalne zmiany w profilu wiązania Ge-FITC po stymulacji przy użyciu LPS oraz określić wpływ badanego inhibitora na odpowiedź makrofagów po stymulacji ligandami TLR.

Macrophages as cells of the immune system constitute one of the first lines of host defense. The presence of large numbers of receptors in their cell membranes makes these cells capable of recognizing a variety of molecular patterns that can be derived from both infectious microorganisms (PAMPs) and damaged host cells (ACAMPs and DAMPs). Molecular complexes that recognize molecular patterns besides the mentioned receptors may also include a variety of accompanying proteins. Recent studies have shown that the HSP70 and HSP90 proteins can dock to the TLR4 due to the recognition of lipopolysaccharide (LPS). There are also reports of inhibitory effects of selective HSP90 inhibitors on the production of proinflammatory cytokines such as IL-1, IL-6, and TNF in human macrophages after stimulation with LPS or Taxol. For these reasons, the HSP90 is a particular subject of interest in current molecular biology.The aim of this work was to visualize HSP90 in human macrophages using a specific inhibitor - FITC-conjugated geldanamycin. Microscopic examination was designed to determine the optimal concentration of the inhibitor and to study the kinetics of its binding to HSP90 in the macrophage cell membrane. It was also planned to examine potential changes in the Ge-FITC binding profile after stimulation with LPS and to determine the effect of the inhibitor on macrophage response after stimulation with TLR ligands.