The alternative, proteolytic-independent role of Porphyromonas gingivalis gingipains in the modulation of immune response

Bibliogr. s. 154-170

Zapalenie przyzębia (paradontoza) jest schorzeniem o pierwotnej etiologii bakteryjnej, w którym następuje zaburzenie działania mechanizmów obrony immunologicznej. W konsekwencji prowadzi ono do rozwoju chronicznego stanu zapalnego powodującego poważne uszkodzenia tkanek okołozębowych. Uważa się, że to Porphyromonas gingivalis jest dominującym drobnoustrojem odpowiedzialnym za rozwój chronicznej postaci tej choroby, a jego głównymi czynnikami wirulencji są zewnątrzwydzielnicze enzymy proteolityczne zwane gingipainami. Proteazy te wykazują bardzo silny wpływ na funkcjonowanie układu immunologicznego gospodarza. Dotychczasowe badania nad mechanizmem działania gingipain koncentrowały się̨ na aktywności proteolitycznej tych enzymów. Udowodniono ich rolę m.in w degradacji peptydów antybakteryjnych gospodarza, białek układu dopełniacza, czy składowych układu krzepnięcia. Gingipainy są eksportowane na zewnątrz komórki bakteryjnej poprzez pęcherzyki wydzielnicze uwalniane z błony komórkowej patogenu. W tej formie mogą ulegać dystrybucji poza obręb biofilmu bakteryjnego, a także mogą zostać zinternalizowane przez komórki nabłonkowe. Aktywność tych enzymów jest hamowana obecnością tlenu oraz inhibitorami proteaz znajdujących się w osoczu (antytrombina III oraz alfa-2-makroglobulina), które jest dominującym składnikiem płynu wypełniającego kieszonki dziąsłowe pacjentów cierpiących na paradontozę. W związku z powyższym, nie można wykluczyć obecności nieaktywnych proteolitycznie form gingipain w tkankach objętych stanem chorobowym. Stąd, celem rozprawy doktorskiej była kompleksowa ocena mechanizmu prozapalnego działania nieaktywnych proteolitycznie gingipain w kontekście zapalenia przyzębia. W toku badań, stosując modele in vitro w postaci linii unieśmiertelnionych keratynocytów dziąsłowych TIGKs (ang. telomerase immortalized gingival keratinocytes) i komórek dendrytycznych zróżnicowanych z monocytów (moDC, ang. monocyte derived dendritic cells) udowodniono, że nieaktywne katalitycznie formy gingipain indukują̨ znamiennie wyższą̨ ekspresję mediatorów stanu zapalnego, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka w stosunku do aktywnych proteolitycznie enzymów. Ponadto, indukcja tego procesu jest specyficzna dla gingipain argininowych, a najsilniejszy efekt obserwowany jest w przypadku proteazy RgpA. Zaobserwowany fenomen potwierdzono również w badaniach z wykorzystaniem izogenicznych mutantów podjednostki katalitycznej gingipain oraz szczepu dzikiego poddanego inaktywacji enzymatycznej poprzez zastosowanie wysoce specyficznych inhibitorów gingipain - KYT. Ze względu na brak aktywności proteolitycznej, nieaktywne gingipainy nie mogą wykorzystywać receptorów PAR do inicjacji przekazu sygnału, dlatego też postawiono hipotezę, że nieaktywna proteaza wzmaga rozwój stanu zapalnego na innej drodze niż aktywna forma enzymu, będąc rozpoznawana przez nieznany receptor powierzchniowy na komórkach gospodarza. W kolejnej części badań podjęto więc próbę bezpośredniej identyfikacji tego receptora. Poprzez metody obrazowania przy użyciu mikroskopii konfokalnej określono lokalizację nieaktywnych gingipain na powierzchni komórki gospodarza. Typowanie białek eksponowanych na powierzchni błony komórkowej komórek TIGKs zdolnych do oddziaływania z nieaktywną i aktywną gingipainą RgpA wykonano, przy zastosowaniu metody sieciowania chemicznego oraz immunoprecypitacji ze specyficznymi dla gingipain przeciwciałami. Analiza kompleksów ligand-gingipaina, przeprowadzona przy użyciu spektroskopii masowej, wykazała potencjalne białka błonowe mogące wchodzić w interakcje z badanymi enzymami. Kolejnym krokiem była analiza szlaku sygnałowego indukowanego nieaktywnymi proteazami P. gingivalis w oparciu o model indukcji ekspresji IL-6, cytokiny kluczowej ze względu na jej rolę w procesie degradacji tkanki kostnej. Zastosowane blokowanie szlaku PI3K inhibitorem LY294002 spowodowało znamienne zahamowanie indukcji badanej cytokiny w przypadku nieaktywnej RgpA, co wskazuje na jego zaangażowanie w indukcję odpowiedzi prozapalnej indukowanej nieaktywnym enzymem. Metodą Western Blot wykazano również̇ aktywację białka AKT, jednej z głównych kinaz szlaku PI3K, po stymulacji komórek nieaktywnymi proteolitycznie formami enzymu oraz aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB, co końcowo prowadzi do zwiększonej ekspresji genu kodującego IL-6. W kolejnej części pracy skupiono się na określeniu, jak wykazany mechanizm regulacji ekspresji IL-6 przez bakterie gatunku P. gingivalis oraz ich czynniki wirulencji wpływa na różnicowanie limfocytów w subpopulację Th17. Przeprowadzone badania wykazały, że stymulacja komórek prezentujących antygen bakteriami o zahamowanej aktywności gingipain wpływa na zwiększenie produkcji cytokin prozapalnych niezbędnych do różnicowania w kierunku Th17 (IL-6, IL-21, IL-23, IL-1β). Konsekwencją tego jest proliferacja i różnicowanie naiwnych limfocytów CD4+ w kierunku populacji Th17. Zauważalna jest również aktywacja pozytywnych regulatorów szlaku indukcji IL-17, takich jak: IRF4, STAT3, RORc, RORα. W celu zahamowania powstawania populacji Th17, zaproponowano blokadę szlaku sygnałowego IL-6, stosując przeciwciała przeciwko receptorowi dla IL-6, jak również inhibitora kinaz JAK1/2 (Ruxolitinib), co znacząco obniżyło liczebność populacji Th17. Podsumowując, poznanie mechanizmów patogenności bakterii determinujących rozwój chorób cywilizacyjnych, jaką staje się paradontoza, jest kluczowe w procesie projektowania terapii. Uzyskane wyniki sugerują̨ więc, że IL-6 i jej szlak sygnałowy powinna być uwzględniana jako cel w terapiach skierowanym przeciwko działaniu czynników wirulencji bakterii P. gingivalis. Przedstawione dane weryfikują̨ również dotychczasową wiedzę na temat funkcji gingipain w procesie modulacji odpowiedzi immunologicznej i po raz pierwszy przedstawiają rolę nieaktywnych enzymatycznie proteaz w indukcji stanu zapalnego. Dodatkowo otwierają również dyskusję nad zakwalifikowaniem gingipain do grupy tzw. "moonlighting proteins"- białek wielofunkcyjnych, co może skłonić do poszukiwania kolejnych białek bakteryjnych wykazujących podobne właściwości.

Periodontitis is a chronic inflammatory condition affecting tissues that surround and support the teeth, called periodontium. The disease is initiated by pathogenic bacteria, which strongly stimulate local inflammatory reaction. Deregulation of the immune system leads to sustained inflammation, tissue destruction and in consequence degradation of the alveolar bone. Porphyromonas gingivalis is a major pathogen responsible for the initiation and progression of chronic periodontitis and gingipains-cysteine proteases are considered as its main virulence factors. Therefore, gingipains are broadly studied but the majority of data are focused on their proteolytic activity, which may affect antimicrobial peptides, complement system, and blood coagulation system. The scope of gingipains activity is potentiated due to their efficient diffusion into surrounding tissues as proteases are secreted as a component of outer membrane vesicles. Bacterial vesicles are secreted into gingival pockets filled with gingival crevicular fluid, which is composed of plasma protein including proteases inhibitors (antithrombin III, alpha-2-macroglobulin). Additionally, diffusion beyond the bacterial biofilm is associated with increased oxygen level, which significantly reduces enzymatic activity of gingipains. Therefore, the presence of catalytically inactive gingipains in the inflamed tissues is highly plausible. Hence, the aim of this doctoral thesis was a comprehensive evaluation of a molecular mechanism that is responsible for the pro-inflammatory role of proteolytically inactive gingipains. Using in vitro model of immortalized human gingival keratinocytes (TIGKs) as well as dendritic cells (moDC) we have shown, that enzymatically inactive gingipains strongly promote expression of pro-inflammatory mediators on both, mRNA and protein level, when compared to fully active enzymes. This observation is characteristic only for arginine-specific gingipains, with RgpA as the most effective inducer of the immune response. Above phenomenon was confirmed by using P. gingivalis isogenic mutant of a catalytic domain, and wild type strain inactivated with specific gingipain inhibitors KYT. Proteolytically inactive RgpA cannot use PAR receptors to initiate the signal transduction, therefore we postulate that host recognizes that inactive protease by an unknown surface receptor. Hence, we aimed to identify a receptor that recognizes gingipains on epithelial cells. Initially, by using confocal microscopy imaging, we revealed that gingipains preferentially bind in the area of lipid rafts. Then using chemical cross-linking and immunoprecipitation techniques we have selected a group of several membrane proteins that can participate in the recognition of inactive gingipain. In the next step, we analyzed the intracellular signal transduction pathway induced by the proteolytically inactive enzyme. As a model, we have chosen IL-6, as this cytokine is considered as crucial in the process of bone loss induction. By using LY294002, a selective inhibitor of PI3K pathway we documented that upregulation of inflammatory mediators by inactive gingipains depends on this signaling pathway. The Western Blot analysis revealed the significant phosphorylation of AKT kinases and activation of NF-κB transcription factor induced by catalytically inactive RgpA, which leads to increased IL-6 expression. The last part of the study was focused on determining the role of the observed phenomenon on differentiation of naive T lymphocytes CD4+ into the Th17 subpopulation. The conducted research showed that stimulation of antigen presenting cells with bacteria with suppressed gingipain activity contributes to the increased production of pro-inflammatory cytokines necessary for differentiation into Th17 (IL-6, IL-21, IL-23, IL-1β). The consequence of this process is the proliferation and differentiation of naive CD4+ lymphocytes towards Th17 population. Obtained results corroborate with activation of positive regulators of the IL-17 induction pathway, such as: IRF4, STAT3, RORc and RORα. Finally, we revealed the inhibition of the Th17 differentiation, induced by inactive gingipains, by application of anti-IL-6 receptor antibodies, as well as a JAK1/2 kinase inhibitor (Ruxolitinib). To conclude, detailed identification of mechanisms that determine the virulence of P. gingivalis is crucial in in designing adequate and effective therapy against periodontitis. As we revealed the modulation of IL-6 signaling should be considered in this regard. Moreover, presented data complete our knowledge about the immunomodulatory role of gingipains and showed for the first time the molecular pathway induced by proteolytically inactive enzymes. Finally, these studies can also open the discussion on the qualification of gingipain to the group of multifunctional proteins called "moonlighting proteins", and stimulate the scientific world to conduct similar studies.