Effect of Wnt3a protein on melanoma cells

Białko Wnt3a należące do rodziny ligandów Wnt jest aktywatorem ścieżki sygnałowej Wnt/β-katenina. Jest to konserwatywny szlak regulujący między innymi proliferację, morfologię oraz przeżywalność komórek, a także rozwój osi ciała oraz narządów w rozwoju embrionalnym. Szlak ten zyskuje coraz większą popularność w badaniach nad biologią i leczeniem nowotworów, w tym czerniaka przerzutowego.W niniejszej pracy zbadano wpływ ligandu Wnt3a na proliferacje, cytoszkielet, migrację oraz aktywacje ścieżki Wnt/β-katenina stosując takie metody jak: Western blot, MTT, RT-qPCR, barwienie fluorescencyjne oraz test rysy. Użyto komórek czerniaka linii komercyjnie dostępnej A375 i dla porównania komórek wyprowadzonych z przerzutu z węzła chłonnego - DMBC21. Celem pracy było wyznaczenie punktów czasowych zmian poziomów wybranych białek tej ścieżki jakimi są: aktywowany koreceptor specyficzny dla ścieżki - p-LRP5/6, białka kompleksu degradacyjnego - AXIN1 i pGSK3β oraz białko efektorowe szlaku – β-kateninę, a także onkogenu c-Myc do dalszych badań nad rolą białka RIPK4 w tym szlaku. Wykazano, że rekombinowane białko Wnt3a aktywuje szlak Wnt/β-katenina w komórkach A375, a nie DMBC21. Towarzyszył temu wzrost poziomu transkrypcji genów AXIN-2, TCF7 i LEF1 oraz obniżenie poziomu DKK-1. Co więcej razem z aktywacją badanego szlaku malał poziom białka RIPK4, co było zbieżne z obniżonym poziomem transkryptu jego genu. Z tego powodu wyciszono dany gen za pomocą specyficznego siRNA, co jednak nie wpłynęło na poziom badanych transkyptów. Ponadto w komórkach A375 inkubowanych z Wnt3a zaobserwowano zmiany w cytoszkielecie aktynowym komórek A375 oraz zahamowanie migracji komórek, co warto by potwierdzić dalszymi badaniami.Wyniki otrzymane w ramach niniejszej pracy stanowią podstawę do dalszych badań.

The Wnt3a protein, belonging to the Wnt ligand family, activates the Wnt/β-catenin signaling pathway. It is a conserved pathway that regulates inter alia: cell proliferation, morphology, and survival, as well as the development of the body axis and organs in embryonic development. This pathway is gaining popularity in biological research and treatment of cancer, including metastatic melanoma.In this study, the influence of Wnt3a ligand on proliferation, cytoskeleton migration and activation of the Wnt/β-catenin pathway was investigated using such methods as: Western blot, MTT, RT-qPCR, fluorescence staining and scratch test. Melanoma cells of the commercially available line A375 were used, and for comparison the cells derived from lymph node metastasis - DMBC21. The aim of the study was to determine the time points of changes in the levels of selected proteins in this pathway, such as: an activated pathway-specific coreceptor - p-LRP5 / 6, proteins of the degradation complex - AXIN1 and pGSK3β, and the pathway effector protein - β-catenin, as well as the oncogene c Myc to further research into the role of RIPK4 in this pathway.Recombinant Wnt3a protein has been shown to activate the Wnt/β-catenin pathway in A375 cells and not DMBC21. It was accompanied by an increase in the transcription level of AXIN-2, TCF7 and LEF1 genes and a decrease in the level of DKK-1. Moreover, along with the activation of the studied pathway, it decreased the level of RIPK4 protein, which was consistent with the decreased level of his gene transcript. For this reason, the gene was silenced with a specific siRNA, which, however, did not affect the level of the tested transcript. Furthermore, in A375 cells incubated with Wnt3a, changes in the actin cytoskeleton of A375 cells and inhibition of cell migration were observed, which requires further analysis.The results obtained in this study constitute the basis for further research.