Optimization of in vitro culture of murine bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the bioactive microvesicle isolation

Mezenchymalne komórki macierzyste (z ang. mesenchymal stem cells; MSC) ze względu na swój szeroki potencjał różnicowania, aktywność parakrynną, niską immunogenność i zdolności immunomodulacyjne od lat pozostają przedmiotem zainteresowania medycyny regeneracyjnej. Jednakże, zastosowanie terapii komórkowych budzi obawy o długofalowe skutki przeczepienia komórek, w tym możliwość transformacji nowotworowych. W tym kontekście, nowe perspektywy terapii otwiera możliwość wykorzystania bioaktywnych mikropęcherzyków ( z ang. microvesicles; MV), złuszczanych z powierzchni komórek, w tym komórek macierzystych, oraz zdolnych do modulowania fenotypu i funkcji komórek docelowych poprzez transfer receptorów powierzchniowych, białek, lipidów i kwasów nukleinowych. Dotychczasowe doniesienia sugerują, że proces złuszczania mikrofragmentów oraz ich biologicznie aktywna zawartość zależy od stanu fizjologicznego komórki, stąd istnieje potrzeba optymalizacji warunków hodowli komórek donorowych in vitro w celu pozyskania z nich MV o możliwie najwyższym potencjale terapeutycznym. W niniejszej pracy porównano dwa protokoły hodowli mysich szpikowych MSC: 1) hodowlę w standardowych warunkach, tj. medium DMEM/F12 z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (z ang. fetal bovine serum; FBS) oraz 2) hodowlę w warunkach bezsurowiczych, tj. medium DMEM/F12 z dodatkiem albuminy wołowej (z ang. bovine serum albumin; BSA). Analiza cytometryczna profilu antygenów powierzchniowych oraz cyklu komórkowego nie wykazała różnic pomiędzy porównywanymi grupami MSC w obu zastosowanych pożywkach. Natomiast, zaobserwowano zmienioną morfologię, zahamowanie aktywności proliferacyjnej i metabolicznej oraz obniżoną żywotność komórek w DMEM/F12+0,5% BSA, w porównaniu do MSC w DMEM/F12+10% FBS. Mikrofragmenty pozyskane poprzez ultrawirowanie medium kondycjonowanego zebranego z obu hodowli MSC wykazywały ekspresję niektórych antygenów powierzchniowych komórek donorowych, tj. CD49e, CD105, Sca-1, CD29, CD81 i CD90. Nie stwierdzono istotnych różnic w fenotypie i wielkości MV pomiędzy analizowanymi grupami. Analiza genetyczna ekspresji wybranych genów metodą PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że jedynie w przypadku MV pozyskanych z MSC hodowanych w medium z surowicą nastąpił transfer transkryptów dla ważnych regulatorów procesów kardiomiogenezy i angiogenezy, takich jak Mesp-1, Gata-4, Gata-2 i VE-kadheryna, czego nie obserwowano dla MV pozyskanych z MSC hodowanych w medium bezsurowiczym.W świetle powyższych wyników, wydaje się, że utrzymanie standardowych warunków hodowli, tj. obecność surowicy w składzie medium hodowlanego warunkuje optymalny fenotyp i funkcje komórek MSC in vitro. Zaobserwowana obecność transkryptów dla genów związanych z procesem kardiomiogenezy i angiogenezy, jedynie w MV pochodzących z komórek MSC hodowanych w medium z surowicą sugeruje zasadność wykorzystania tego protokołu hodowli MSC w celu pozyskania bioaktywnych MV, których potencjał terapeutyczny zostanie dalej zbadany w modelach zawału mięśnia sercowego in vivo.

Mesenchymal stem cells (MSC) due to their wide differentiation potential, paracrine activity, low immunogenicity and immunomodulatory properties have been for years in the limelight of regenerative medicine. However, many concerns related to long-term outcomes of cell therapy, including possible tumor formation, still remain to be resolved. In this context, bioactive microvesicles (MV) may be an alternative for use of whole cells for therapy. MV are shed from cell surface and capable of modulating phenotype and function of target cells via transfer of surface receptors, proteins, lipids and nucleic acids. According to previous reports, it has been suggested that both MV shedding process and their bioactive cargo composition were affected by cell physiological state. Thus, there is a need for optimization of in vitro cell culture procedure to obtain MV with possibly greatest therapeutic potential.In this study, two protocols for in vitro culture of murine bone marrow-derived MSC were compared, namely, 1) standard culture in medium DMEM/F12 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) or 2) culture in serum-free conditions with employing medium DMEM/F12 with 0,5% bovine serum albumin (BSA).Cell surface antigen profile and cell cycle analysis by flow cytometry did not reveal any significant differences between the two MSC groups. However, some adverse changes of cell morphology, decreased proliferation and metabolic activity, as well as impaired viability of MSC cultured in medium DMEM/F12+0,5% BSA were observed, when compared to MSC cultivated in medium DMEM/F12+10% FBS.Microvesicles isolated by ultracentrifugation of conditioned media collected from both MSC cultures, expressed some of MSC surface markers, such as CD49e, CD105, Sca-1, CD29, CD81 and CD90. No significant differences in phenotype or size were observed between the two MV groups. Expression of selected genes was studied by real time PCR. Transfer of transcripts for some crucial regulators of angiogenesis and cardiomyogenesis, such as MESP-1, Gata-4, Gata-2 and VE-cadherin was observed for MV derived from MSC cultured in medium DMEM/F12+10%FBS. Importantly, none of these transcripts were detected in the MV fraction derived from MSC cultured in serum-free conditions.According to these results, it seems that standard culture conditions, where serum is present, are still optimal for normal phenotype and function of MSC in vitro. Based on the observation about the presence of transcripts for vast regulators of cardiomyogenesis and angiogenesis only in MV derived from MSC cultured in presence of serum, we conclude that use of this protocol may be optimal for harvesting of MV with greatest therapeutic potential, which will be further evaluated in in vivo model of acute myocardial infarction.