Protokół znakowania białek izotopami 13C, 15N i 2H w owadzim systemie ekspresji Sf9

Magnetyczny rezonans jądrowy (z ang. NMR) jest powszechnie stosowanym i wysoce efektywnym narzędziem do badań strukturalnych białek. Ważną rolę w tej metodzie odgrywa zastosowanie magnetycznie czynnych izotopów węgla i azotu (odpowiednio 13C i 15N), które są wbudowywane do cząsteczki białka na etapie ekspresji. Zwiększając efektywność analizy strukturalnej, znakowanie izotopowe pozwala badać cząsteczki o masie większej niż 10 kDa. Dodatkowe znakowanie deuterem (2H) powoduje dalszą poprawę rozdzielczości widm, rozszerzając zastosowanie techniki do białek osiągających kilkaset kDa.W niniejszej pracy zaprezentowano nowatorski skład pożywki wraz z protokołem ekspresji wzbogaconych izotopowo białek w systemie owadzim Sf9. Jako główne źródło aminokwasów wykorzystano znakowany ekstrakt z alg. Protokół umożliwia ekspresję złożonych białek, trudnych do produkcji w bakteryjnym systemie E.coli. Podstawą do opracowania składu pożywki była dokładna analiza metabolizmu poszczególnych aminokwasów w komórkach Sf9. To podejście umożliwiło pięciokrotne obniżenie kosztów znakowania w odniesieniu do komercyjnie dostępnych mediów, jednocześnie pozwalając na wprowadzenie nowych, dotychczas niedostępnych, kombinacji izotopów. W rezultacie, udało się po raz pierwszy otrzymać deuterowane białko w systemie owadzim.Przedstawiony protokół umożliwia ekspresję białek znakowanych izotopami 13C, 15N i 2H w różnych kombinacjach, z inkorporacją rzędu 75 – 85%. Efektywność metody pozwala już w małej skali ekspresji (30 ml) otrzymać wystarczające ilości białka do zarejestrowania widm NMR o wysokiej jakości.

Nuclear magnetic resonance (NMR) is a commonly used and efficient tool for structural studies on proteins. This method is strongly facilitated by uniform labeling of targets with NMR active isotopes of carbon and nitrogen (13C and 15N, respectively). Incorporation of these isotopes enables work with proteins larger than 10 kDa, whereas labeling with deuterium (2H) additionally improves the resolution of spectra allowing work with particles with sizes up to several hundred kDaltons.This work presents a formulation of a labeling medium together with an optimized protocol for protein expression in Sf9 insect cells. The medium is based on an isotope-labeled algal extract as the main source of amino acids. The protocol enables expression of proteins too complex to be obtained in the E.coli system.A thorough analysis of amino acid metabolism in Sf9 cells was the basis for optimization of the medium composition. The final formulation enabled to reduce the costs of labeling five-fold, when compared to the commercially available media and to expand the number of possible labeling patterns.Owing to the novel approach, uniform deuteration was performed for the first time in a higher eukaryotic expression system. The protocol robustly provided various combinations of 13C, 15N and 2H labels, with 75 – 85% of isotope incorporation. Expression at small scale (30 ml) yielded sufficient protein amounts to perform NMR experiments and obtain spectra of a good quality.