Physicochemical properties of melanins isolated from melanoma cells

Melanina jako naturalny filtr przeciwsłoneczny oraz efektywny antyoksydant chroni upigmentowane tkanki przed uszkodzeniami fotochemicznymi. Jednakże spora ilość dowodów eksperymentalnych wskazuje na udział melanin w reakcjach fototoksycznych oraz ich rolę w rozwoju czerniaka. W porównaniu do innych komórek nowotworowych, komórki czerniaka mogą syntezować melaninę w dużych ilościach, stając się wówczas mocno upigmentowane.W ramach pracy magisterskiej, zbadano właściwości fizykochemiczne melanin wyizolowanych w formie melanosomów z trzech czerniakowych linii komórkowych: SK-MEL-16, MNT-1 oraz B16F10.Określenie zatem podstawowych właściwości fizycznych i chemicznych melanin może wyjaśniać, dlaczego w leczeniu czerniaka terapia fotodynamiczna jest nieskuteczna. Stąd w pracy zwrócono szczególną uwagę na metody badawcze mogące określić fotoprotekcję i fotoreaktywność melanin oraz wpływ fotooksydacji na tworzenie się reaktywnych form tlenu.W celu przeprowadzenia dokładniejszych badań zmian fizykochemicznych właściwości melanin, posłużono się określonymi technikami spektroskopowymi. Wykonano tlenometrię EPR, a także pułapkowanie spinowe w celu pomiaru konsumpcji tlenu oraz formowania się anionorodnika ponadtlenkowego pod wpływem naświetlania melaniny światłem z zakresu UV-VIS. W przypadku określenia fotogeneracji tlenu singletowego wykorzystano spektrskopię fotoluminescencji rozdzielonej w czasie (TRPL). Najszybszą fotokonsumpcję tlenu przy naświetlaniu promieniowaniem UVA zaobserwowano dla lnii komórkowej SK-MEL-16, która wyniosła 0,07 µM/s, zaś najniższą dla linii MNT-1 wynosząca zaledwie ~0,0068 µM/s, co pokazuje, że linia SK-MEL-16 cechuje się 10-krotną wyższą fotoreaktywnością. W przypadku wykorzystania światła niebieskiego, linia komórkowa B16F10 zdominowała konsumpcję tlenu, osiągając 0,045 µM/s, zaś linia MNT-1 najniższą ~0,05 µM/s. Jednocześnie największą wydajność kwantową w gaszeniu tlenu singletowego wykazała linia MNT-1, co może świadczyć o tym, że właściwości fotoproteksycjne eumelaniny w tej linii rekompensują fototoksyczne właściwości feomelaniny. Jeśli chodzi o wydajność generowania tlenu singletowego, spektroskopia TRLP wykazała, że dla obu badanych długości fal (365 nm i 445 nm) linia SK-MEL-16 cechuje się największą wydajnością kwantową w generowaniu tlenu singletowego. Wykorzystując rezonans paramagnetyczny wykryto addukt spinowy DMPO-OOH. Zarówno w przypadku naświetlania promieniami z zakresu UV-VIS, silne sygnały widm EPR zostały zarejestrowane dla linii SK-MEL-16, a najsłabsze dla linii MNT-1. Przy czym należy zwrócić uwagę na to, że wraz ze wzrostem czasu naświetlania, linia komórkowa SK-MEL-16 wykazuje intensywną zmianę sygnału w widmie EPR DMPO-OOH, tzn. po osiągnięciu maksimum obserwuje się spadek intensywności sygnału. Prawdopodobnie ma to związek z dwufazowością - degradacja DMPO-OOH w wyniku powstałych fotoproduktów lub wzbudzenie stanów samej melaniny.

Melanin is a natural sunscreen and a potent antioxidant that protects pigmented tissues from photochemical damage. However, a large body of experimental evidence suggests that melanins are involved in phototoxic reactions and play a role in the development of melanoma. Compared to other cancer cells, melanoma cells can synthesize melanin in large amounts and thus become highly pigmented.The master's thesis investigated the physicochemical properties of melanins isolated in the form of melanosomes from three melanoma cell lines: SK-MEL-16, MNT-1 and B16F10 studied.Determining the basic physical and chemical properties of melanins may explain why photodynamic therapy is ineffective in treating melanoma. Therefore, this study focuses on research methods that can determine the photoprotection and photoreactivity of melanins and the effects of photooxidation on reactive oxygen species formation.Specific spectroscopic techniques were used to further investigate the changes in the physicochemical properties of melanins. EPR oximetry was performed as well as spin trapping to measure oxygen consumption and superoxide radical anion formation upon irradiation of melanin with UV-VIS light. Time-resolved photoluminescence spectroscopy (TRPL) was used to determine singlet oxygen photogeneration. The fastest photoconsumption of oxygen under UVA irradiation was observed for the SK-MEL-16 cell line, which was 0.07 µM/s, and the lowest for the MNT-1 line, which was only ~0.0068 µM/s, showing that the SK-MEL-16 line has a 10-fold higher photoreactivity. When blue light was used, the B16F10 cell line dominated oxygen consumption, reaching 0.045 µM/s, while the MNT-1 line showed the lowest value of ~ 0.05 µM/s. At the same time, the MNT-1 line showed the highest quantum efficiency in quenching singlet oxygen, which may indicate that the photoprotective properties of eumelanin in this line compensate for the phototoxic properties of pheomelanin. As for the efficiency of singlet oxygen generation, TRLP spectroscopy showed that for both wavelengths tested (365 nm and 445 nm), the line SK-MEL-16 has the highest quantum efficiency in generating singlet oxygen.The DMPO-OOH spin adduct was detected by paramagnetic resonance. Both irradiation with beams in the range UV-VIS recorded strong signals of the EPR spectra for the SK-MEL-16 line and the weakest for the MNT-1 line. It should be noted that the SK-MEL-16 cell line shows a strong change of the signal in the DMPO-OOH EPR spectrum with increasing exposure time, i.e. after reaching the maximum, a decrease of the signal intensity is observed. This is probably related to the biphasic nature - degradation of DMPO-OOH by the resulting photoproducts or excitation of melanin states themselves.