Projektowanie nowych białkowych modułów systemu detekcji wirusa Zika

Wybuch epidemii gorączki Zika w 2015 roku stanowi wyzwanie dla społeczności naukowej do zapewnienia nowych metod diagnostycznych i środków terapeutycznych. Wcześniej uważany za rzadki i niegroźny dla ludzi patogen, wirus Zika jest obecnie uznawany przez Światową Organizację Zdrowia za zagrażający zdrowiu publicznemu na całym Świecie. Zakażenie wirusem Zika może wiązać się z wystąpieniem zespołu Gulliana-Barrégo oraz zniekształceń płodu i poronień u kobiet w ciąży. Obecnie nie są dostępne szczepienia oraz leki chroniące przed gorączką Zika. Fakt, że większość przypadków zachorowań notowana jest w krajach słabo rozwiniętych stwarza potrzebę opracowania systemu detekcji wirusa Zika w warunkach polowych.Celem badań opisanych w niniejszej pracy była optymalizacja systemu detekcji SEGIA ang. „Split-enzyme” protein G based ImmunoAssay, opracowanego w naszym laboratorium, i jego przystosowanie do wykrycia białek wirusa Zika. SEGIA składa się z dwóch białkowych modułów: komplementarnych fragmentόw β-laktamazy TEM-1 połączonych z białkiem G oraz syntetycznych Fabόw (sFab). Rozpoznanie przez sFaby dwόch niepokrywających się eptiopόw antygenu skutkuje zbliżeniem fragmentόw enzymu i jego rekonstytucją umożliwiającą odczyt sygnału. Planowane prace zakładały przygotowanie sFabόw rozpoznających niepokrywające się epitopy niestrukturalnych białek wirusa Zika. W celu selekcji fagόw prezentujących sFaby wykorzystany został protokół ekspresji fagowej oparty o SNAP-tag. ORF kodujące proteazę, metylotransferazę i helikazę Zika zostały wklonowane do wektora SNAP-tag zawierającego metkę histydynową. Po ekspresji i chromatografii powinowactwa do jonów kobaltu, zbiotynylowane białka wykorzystano do selekcji sFabόw z preparatu fagów M13 prezentujących sFaby, uzyskanego z biblioteki fagemidowej. Wyniki wstępnych testόw ELISA wiązania sFabόw zostały potwierdzone przez badania techniką dot-blot oraz powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR).Po włączeniu sFabόw rozpoznających niepokrywające się epitopy metylotransferazy Zika do systemu SEGIA został on przetestowany pod kątem zdolności wykrycia tego białka. Wyniki prezentowane w niniejszej pracy wskazują, że SEGIA jest potencjalnym systemem diagnostycznym zakażeń wirusem Zika, do wykorzystania w warunkach polowych, wykrywającym metylotransferazę wirusa w zakresie stężeń 31 nM – 250 nM.

Zika virus (ZIKV) outbreak observed in 2015 constitutes a challenge for the scientific community to provide new Zika diagnostics and therapeutics.  Previously considered as a mild and rare pathogen for humans, ZIKV has now been classified as a public health emergency of international concern by the World Health Organization. The pathogen may entail occurrence of Guillan-Barre syndrome and fetal damage or even miscarriage in case of early pregnancy maternal infection. Up to this date there are no antiviral drugs or vaccines available for protection from or treatment of ZIKV infection. Since most cases of infection are noted in underdeveloped countries, development of a point-of-care diagnostic system for Zika infection would be for the benefit of public health.The goal of the presented study was to optimize a protein detection system “Split-enzyme” protein G based ImmunoAssay (SEGIA), previously developed in our laboratory, and to adapt the system for ZIKV detection. SEGIA is a modular system composed of TEM-1 β-lactamase complementary fragments fused to protein G and synthetic antigen-binding fragment of antibodies (sFabs). Once sFabs recognize two non-overlapping epitopes of antigen the enzyme fragments are brought to close proximity and the enzyme reconstitutes enabling signal detection. To that end, sFabs specifically recognizing two non-overlapping epitopes of viral non-structural proteins were to be generated. SNAP-tag based phage display biopanning protocol was utilized for selection of sFab presenting phage. The target ZIKV proteins: protease, methyltransferase and helicase were cloned into a (His6) SNAP-tag vector, expressed and purified by IMAC. Each produced protein was biotinylated and served as a target for selection of binders from a mixture of sFabs-presenting M13 phage, prepared from a phagemid library, followed by ELISA screening. This resulted in producing several sFabs for each of the selection targets, which were then verified and characterized by dot-blot immunoassays and Surface Plasmon Resonance (SPR). After incorporation of sFabs recognizing two non-overlapping epitopes of ZIKV methyltransferase to SEGIA the system was tested for detection of this ZIKV target. The study demonstrates that SEGIA is a good candidate for a point-of-care diagnostic system for ZIKV infection with dynamic range between 31 and 250 nM concentration of the antigen.