Ścieżki sygnalizacyjne ApoE4: wpływ na model bariery krew-mózg in vitro

Bariera krew-mózg (BBB) utrzymuje homeostazę, zapobiegając swobodnemu wnikaniu toksyn i komórek odpornościowych do centralnego układu nerwowego, a także dostarczając składniki odżywcze do mózgu. Zgodnie z obecną hipotezą naczyniowo-mózgową choroby Alzheimera, bariera krew-mózg jest upośledzona już we wczesnych stadiach choroby z powodu zaburzonego usuwania amyloidu beta (Aβ) oraz jego akumulacji w tkance mózgowej. Głównym dowodem na uszkodzenie bariery jest obniżona ekspresja białek złączy ścisłych komórek śródbłonka, a także zwiększona przepuszczalność bariery. Izoformy apolipoproteiny E, głównie E3 i E4, mogą wiązać się z Aβ i wpływać na jego usuwanie. Ponadto gen APOE jest dobrze znanym czynnikiem ryzyka choroby Alzheimera. W niniejszej pracy magisterskiej zbadano wpływ apoE3/4 na ludzkie immortalizowane komórki śródbłonka mózgu ( linia komórkowa hCMEC/D3) stanowiące model in vitro ludzkiej bariery krew-mózg. Za pomocą metody Western blot, zbadano ekspresję dwóch cząsteczek sygnałowych regulujących złącza ścisłe: kinazy białkowej C eta (PKCη) i cyklofiliny A (CypA) po traktowaniu komórek hCMEC/D3 izoformami apoE3/4. Ponadto, aby potwierdzić obecność białek tworzących złącza ścisłe pomiędzy komórkami hCMEC/ D3, przeprowadzono barwienia immunocytochemiczne.Spodziewano się zaobserwować wyższą ekspresję CypA i fosforylowanego PKCη w komórkach traktowanych apoE4 w porównaniu do komórek traktowanych apoE3. Jednakże nie wykazano żadnych znaczących zmian w fosforylacji PKCη i ekspresji CypA. W eksperymentach immunocytochemicznych, po optymalizacjach protokołu zademonstrowano ekspresję białek złączy ścisłych: klaudyny-5 i zona occludens-1 (ZO-1). Komórki linii hCMEC/D3 okazały się odpowiednim modelem dla niniejszego projektu badawczego, niemniej jednak, należy przeprowadzić dalsze badania, aby ocenić czy różne dawki i czas ekspozycji, jak również stan lipidacji izoform apoE mogą przyczynić się do zmian w fosforylacji PKCη jak i ekspresji CypA, a w konsekwencji białek złączy ścisłych.

The blood brain barrier (BBB) maintains homeostasis within the brain preventing from free entry of toxins and immune cells as well as providing nutrients into the central nervous system (CNS). According to the recent cerebrovascular hypothesis of Alzheimer's disease (AD), the BBB is compromised in early stages of the disease due to malfunctioned amyloid β (Aβ) clearance and its accumulation within the brain parenchyma. The major evidence for the BBB disruption is decreased expression of endothelial cells tight junction (TJ) proteins and increased permeability of the BBB. Apolipoprotein E isoforms , mostly E3 and E4, may bind to Aβ and affect its clearance. Moreover, APOE gene is a well-known risk factor for AD. Therefore, in the project we tested the effect of apoE3/4 treatment on human immortalized brain endothelial cells (hCMEC/D3) - an in vitro model of human BBB. Expression of two signaling molecules regulating TJ: protein kinase C eta (PKCη) and cyclophilin A (CypA) was examined in Western blot assay after apoE3/4 treatment of hCMEC/D3 cells. Moreover, immunocytochemistry (ICC) studies were performed to confirm the presence of tight junctions between hCMEC/D3 cells.Higher expression of CypA and phosphorylated PKCη in apoE4-treated cells was expected in comparison to apoE3-treated cells. However, no relevant changes in PKCη phosphorylation and CypA expression were shown. Expression of Claudin-5 and zona occludens-1 (ZO-1), two proteins present in TJs was demonstrated in ICC assays after several improvements of the protocol . hCMEC/D3 were proved to be a suitable model for our project, however, further studies need to be performed to assess whether different dosage and exposure time, as well as lipidation status of apoE isoforms may contribute to expression shifts of phosphorylated PKCη, CypA and in consequence, tight junctions proteins.