Obtaining the recombinant insect’s PHO protein, its fragments and studying their physicochemical properties.

Białko PHO występuje u Drosphila melanogaster, należy do rodziny białek Polycomb Group (PcG) i kodowane jest przez gen pho. Białko to wykazuje ortologię z ssaczym czynnikiem transkrypcyjnym Yin Yang-1 (YY1). PHO pełni ważną funkcję w utrzymaniu wzorca ekspresji genów segmentacji oraz genów homeotycznych (Hox), kontrolujących rozwój morfologiczny konkretnych części ciała w początkowych stadiach rozwojowych. Białka PcG rekrutowane są do DNA w miejscu określanym jako PRE (ang. PcG response elements), a ich działanie oparte jest na tworzeniu dużych kompleksów białkowych - wykazano, że białko PHO łączy się bezpośrednio z elementem PRE poprzez palce cynkowe, oddziałuje ono również z innymi białkami. Ortologia między białkami YY1 i PHO występuje w dwóch domenach YY1: na krótkim odcinku między resztami 205-226 białka YY1 oraz pomiędzy resztami aminokwasowymi stanowiącymi cztery palce cynkowe, gdzie poziom identyczności wynosi 95 %. Pomimo faktu, że pozostała część YY1 nie wykazuje istotnego podobieństwa do PHO to rejony o wysokim stopniu podobieństwa sugerują, że ssacze białko YY1 może być odpowiednikiem białka PHO u kręgowców, a zatem działać jako białko PcG. Celem niniejszej pracy, było uzyskanie przy pomocy technik inżynierii genetycznej trzech konstruktów genetycznych, których wykorzystanie umożliwiła uzyskanie białka o całej długości, fragmentu N-końcowego oraz fragmentu C-końcowego zawierające palce cynkowe. Następnym krokiem było znalezienie najbardziej odpowiednich warunków ekspresji uzyskanych konstruktów, które umożliwiłyby uzyskanie dużej ilości rozpuszczalnego białka. Przetestowano ekspresję pięciu szczepów E. coli w różnych pożywkach bakteryjnych, różnych temperaturach oraz w różnych stężeniach induktora. Po wybraniu satysfakcjonujących warunków ekspresji poszukiwano skutecznego sposobu ich oczyszczania. W tym celu wykorzystano chromatografię pseudopowinowactwa na złożu Ni-NTA, chromatografię powinowactwa na złożu z immobilizowanym DNA, chromatografię jonowymienną oraz sączenie molekularne. Skutecznie udało się oczyścić C-końcową część białka (PHO-ctf). Białko pełnej długości zawierające metkę histydynową (h6tPHO) oraz oraz jego N-końcowy fragment (h6tPHO-ntf) występowały z dodatkowym krótszym fragmentem. Udało się doczyścić białko pełnej długości, niestety nie udało się tego dokonać dla fragmentu N-końcowego. Na podstawie uzyskanych wyników na poszczególnych etapach oraz wyliczeń wartości pI wnioskować można, że brak efektywnego rozdziału jest wynikiem dimeryzacji tych białek. W dalszej kolejności, na uzyskanych preparatach zbadano ich aktywność biologiczną z wykorzystaniem pomiarów dichroizmu kołowego, anizotropii fluorescencji oraz intensywności fluorescencji.Ze względu na to, iż badania te przeprowadzone były po raz pierwszy napotkano szereg trudności, które tylko częściowo udało się rozwiązać. Niemniej, z całą pewnością przed prowadzeniem dalszych badań konieczne jest przede wszystkim odnalezienie skuteczniejszego sposobu oczyszczenia białka h6tPHO oraz h6tPHO-ntf.

The PHO protein found in Drosphila melanogaster, belongs to the Polycomb Group (PcG) family of proteins and is encoded by the pho gene. This protein is orthological to the mammalian transcription factor Yin Yang-1 (YY1). PHO plays an important role in maintaining the expression pattern of segmentation genes and homeotic (Hox) genes that control the morphological development of specific body parts in the early stages of development. PcG proteins are recruited to DNA at a site known as PRE (PcG response elements), and their action is based on the formation of large protein’s complexes - it has been shown that PHO protein binds directly to the PRE element through zinc fingers, PHO also interacts with other proteins.Orthology between the YY1 and PHO proteins is found in the two YY1 domains: the short distance between residues 205-226 of the YY1 protein and between the amino acid residues constituting the four zinc fingers, where the level of identity is 95%. Despite the fact that the remainder of YY1 does not show significant similarity to PHO, regions with a high degree of similarity suggest that the mammalian YY1 protein may be equivalent to the PHO protein in vertebrates and thus act as a PcG protein.The aim of this study, with the help of genetic engineering techniques, was to obtain three genetic constructs, the expression of which allowed to obtain a protein of full length, the N-terminal fragment containing the His-Tag and the C-terminal fragment containing zinc fingers. The next step was to find the most suitable expression conditions for the obtained constructs, which would make it possible to obtain a large amount of soluble protein. The protein’ expression in five E. coli strains, in different bacterial media, different temperatures and different inducer concentrations was tested. After selecting the best possible expression conditions, an effective method of protein purification was sought. For this purpose, pseudo-affinity chromatography on a Ni-NTA resin, affinity chromatography with immobilized DNA, ion-exchange chromatography and molecular filtration were used. The PHO-ctf protein was successfully purified, the h6tPHO and h6tPHO-ntf proteins coexisted with the additional fragment - most likely the two bands visible on the electrophoregram come from the protein and its shortened version. It was not possible to purify the N-terminal fragment - on the basis of the results obtained at individual stages and the calculations of the pI value, it can be concluded that the lack of effective separation is the result of the dimerization of these proteins. For a full-length protein, it was possible to get rid of the coexisting band by using the size-exclusion chromatography. Subsequently, the obtained preparations were tested for their biological activity with the use of circular dichroism, fluorescence anisotropy and fluorescence intensity measurements.Due to the fact that this research was carried out for the first time, a number of difficulties were encountered, which were only partially solved. Nevertheless, before conducting further research, it is certainly necessary to find a more effective way to purify the h6tPHO and h6tPHO-ntf proteins.