Analysis of heme oxygenase-1 promoter polymorphism in induced pluripotent stem cells from patients with Duchenne muscular dystrophy

Dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD) to rzadka choroba genetyczna, prowadząca do postępującego zaniku mięśni z powodu braku dystrofiny. Objawy pojawiają się we wczesnym dzieciństwie, powodując stopniową utratę funkcji ruchowych i przedwczesną śmierć. Jednym z możliwych środków terapeutycznych mogący łagodzić objawy u osób chorych z DMD może być oksygenaza hemowa-1 (HO-1). HO-1 to enzym kodowany przez gen HMOX1, którego podstawową funkcją jest katalizowanie reakcji degradacji toksycznego hemu do tlenku węgla (CO), żelaza (Fe2+) oraz biliwerdyny. HO-1 jest enzymem wykazujący właściwości cytoprotekcyjne, który jest indukowany w odpowiedzi na stres komórkowy. W strukturze promotora genu HMOX1 identyfikuje się obecność polimorfizmu powtórzeń mikrosatelitarnych GTn o potencjalnym znaczeniu prognostycznym i klinicznym. Powtórzenia (GT)n występują w zakresie od 12 do 40 i klasyfikowane są jako promotor typu S (ang. short) dla <25 (GT)n powtórzeń oraz typu L (ang. long) dla ≥25 (GT)n powtórzeń.Głównym celem niniejszej pracy jest zbadanie wpływu polimorfizmu promotora HMOX1 na ekspresję HO-1 w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC) uzyskanych od pacjentów z DMD (hiPSC-DMD) oraz od zdrowych dawców (hiPSC-kontrolne). W pierwszej kolejności zweryfikowano pluripotencjalność wykorzystywanych linii hiPSC przy zastosowaniu cytometrii przepływowej oraz barwień immunofluorescencyjnych. Wykazano, że HMOX1 ulega ekspresji w hiPSC-DMD oraz hiPSC kontrolnych. Nie zaobserwowano wpływu dystrofiny na ekspresję HMOX1. Analiza ekspresji HMOX1 w dystroficznych i kontrolnych hiPSC przy zastosowaniu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR, qPCR) potwierdziła brak istotnych zmian w poziomie mRNA tego genu. Jednakże zaobserwowano tendencję do wyższej ekspresji HMOX1 w liniach z długimi powtórzeniami (GT)n w grupie kontrolnej i w mniejszym stopniu w grupie DMD. Podsumowując, badania wskazują na brak wpływu polimorfizmu HMOX1 na poziom enzymu w komórkach pluripotencjalnych otwierając opcje analizy znaczenia polimorfizmu i wpływu HO-1 na zróżnicowane z hiPSC komórki sercowe.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a rare genetic disease that leads to progressive muscle atrophy due to a lack of dystrophin. Symptoms appear in early childhood, causing gradual loss of motor function and premature death. One possible therapeutic treatment that can relieve symptoms in DMD patients may be heme oxygenase-1 (HO-1).HO-1 is an enzyme encoded by the HMOX1 gene with the primary function of catalyzing the degradation reaction of toxic heme to carbon monoxide (CO), iron (Fe2+) and biliverdin. HO-1 is an enzyme that shows cytoprotective properties and is induced in response to cellular stress. The presence of a polymorphism of GTn microsatellite repeats with potential prognostic and clinical significance is identified in the promoter structure of the HMOX1 gene. The (GT)n repeats range from 12 to 40 and are classified as S-type (short) promoter for <25 (GT)n repeats and L-type (long) promoter for ≥25 (GT)n repeats.The primary aim of this study is to investigate the effect of HMOX1promoter polymorphism on HO-1expression in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) obtained from DMD patients (hiPSC-DMD) and healthy donors (control hiPSC). Firstly, the pluripotency of the used hiPSC lines was confirmed using flow cytometry and immunofluorescence staining. HMOX1 was shown to be expressed in hiPSC-DMD and control hiPSCs. No effect of dystrophin on HMOX1 expression was observed. Analysis of HMOX1 expression in dystrophic and control hiPSCs using polymerase chain reaction (PCR, qPCR) confirmed that there were no significant changes in the mRNA levels of this gene. However, there was a trend toward higher HMOX1 expression in lines with long (GT)n repeats in the control group and to a lesser extent in the DMD group. In conclusion, the study indicates that there is no effect of HMOX1 polymorphism on the level of the enzyme in pluripotent cells opening up options to analyze the significance of the polymorphism and the effect of HO-1 on hiPSC-differentiated cardiac cells.