Low-temperature chlorophyll fluorescence analysis and immunodetection of photosynthetic apparatus proteins during deetiolation in lut2 and npq4 mutants of Arabidopsis thaliana.

Indukowana światłem deetiolacja jest procesem wywołującym wielopoziomowe zmiany rozwojowe w etiolowanych siewkach roślin okrytonasiennych. W trakcie tego procesu dochodzi do różnicowania chloroplastów, uruchomienia biosyntezy podjednostek kompleksów fotosyntetycznych oraz ukończenia szlaku syntezy chlorofili. Pod wpływem światła w liścieniach zieleniejących siewek wykształcony zostaje sprawny aparat katalizujący jasną fazę fotosyntezy. Analiza procesu deetiolacji może ułatwić poznanie mechanizmów biogenezy aparatu fotosyntetycznego, a także umożliwić określenie funkcji poszczególnych jednostek strukturalnych układów w błonie tylakoidowej. W niniejszej pracy magisterskiej badano wpływ białka PsbS oraz luteiny na przebieg wczesnych etapów zielenienia siewek Arabidopsis thaliana. Zastosowanymi modelami badawczymi były sterylne hodowle siewek A. thaliana dzikiego typu oraz mutantów npq4 i lut2, poddawane deetiolacji w warunkach światła białego o natężeniu 100 µmol fotonów · m-2 · s-1. Dzięki wstępnej optymalizacji metody Western blot, udało się zaobserwować różnice czasu i poziomu regulowanej światłem biosyntezy podjednostek kompleksów fotosyntetycznych, takich jak białko PsaA, PsbC, PsbD, Lhca4, Lhcb2 i Lhcb4. Wykazano, iż liścienie mutantów npq4 po 4 h deetiolacji oraz mutantów lut2, zielenionych przez 6 h, posiadają zwiększoną zawartość większości badanych polipeptydów. Poprzez pomiar niskotemperaturowej fluorescencji chlorofilu analizowano także tworzenie fotosyntetycznych kompleksów barwnikowo-białkowych i stwierdzono opóźnienie składania PSI w porównaniu do PSII. Po 4 i 6 h deetiolacji nie zaobserwowano istotnego wpływu mutacji npq4 i lut2 na zdolność formowania kompleksów fotosyntetycznych. Dla siewek pozbawionych luteiny stwierdzono jednak nieznaczne opóźnienie składania PSI, PSII i anten LHC. Dodatkowo, zarówno w hodowlach dzikich, jak i obu mutantów, po 4 i 6 h naświetlania siewek zarejestrowano sygnał, który mógł być emitowany przez protochlorofilid związany z enzymem LPOR. Obecność takiej formy tego barwnika najprawdopodobniej może wskazywać na niedobór NADPH w komórkach

Deetiolation, which is induced by light, causes multilevel developmental changes in seedlings. During this process differentiation of chloroplasts, biosynthesis of photosynthetic complexes and the continuation of the chlorophyll synthesis pathway in greening seedlings occur. Under the influence of light, functional apparatus catalyzing the light phase of photosynthesis is developed in the greening cotyledons. Analysis of the deetiolation process may facilitate the understanding of the mechanisms of the photosynthetic apparatus biogenesis, as well as enable determination of the function of individual structural units in thylakoid membranes’ pigment-protein complexes. In this master’s thesis, the effect of PsbS protein and lutein on early stages of greening process of Arabidopsis thaliana seedlings was analyzed. The research models, which were applied in these studies, were sterile cultivations of wild type and also npq4 and lut2 mutants of A. thaliana seedlings, deetiolated in the 100 µmol photons · m-2 · s-1 intensity of white light. The initial optimization of the Western blot technique allowed to show differences in the time and level of light-initiated biosynthesis of thylakoid complexes subunits, like PsaA, PsbC, PsbD, Lhca4, Lhcb2 and Lhcb4 proteins. It has been demonstrated that cotyledons of npq4 mutants after 4 h of deetiolation and lut2 mutants after 6 h of greening process have increased levels of majority of those proteins. Through the fluorescence measurements of chlorophyll in low temperature, the organization of photosynthetic chlorophyll-protein complexes was analyzed and the delay in assembly of PSI compared to PSII was determined. There was no significant impact of npq4 and lut2 mutations on ability of photosynthetic complexes formation after 4 and 6 h of deetiolation process. However, in the lutein-deficient seedlings the slowdown of the PSI, PSII and LHC antennas assembly was found. In addition, in wild type and both mutants, after 4 and 6 h of exposure to light, the signal, which could be emitted by the protochlorophyllide connected with LPOR enzyme, was recorded. The presence of this form of the protochlorophyllide may, most likely, indicate the deficiency of NADPH in the cells.