The significance of zinc ions in the structure and activity of the MCPIP1 dimer

Białko MCPIP1 jest negatywnym regulatorem stanu zapalnego zapobiegającym jego patologicznemu rozwojowi. Jego aktywność nukleolityczna odpowiada głównie za degradację mRNA cytokin prozapalnych. Najważniejszymi domenami w białku MCPIP1 są domena PIN odpowiadającą za aktywność RNazy oraz motyw palca cynkowego typu CCCH, którego rolą jest rozpoznawanie i wiązanie kwasów nukleinowych. Poza domeną PIN, struktura przestrzenna białka MCPIP1 jest słabo poznana, gdyż pozostałe fragmenty MCPIP1 wykazują dynamikę strukturalną. Uzyskana i rozwiązana przez dr Wilamowskiego struktura kryształu białka MCPIP1[134-327] ujawniła indukowaną cynkiem dimeryzację domen PIN, co jest nietypowym i słabo poznanym mechanizmem interakcji międzycząsteczkowej. Celem pracy było zatem zbadanie struktury przestrzennej dimeru białka MCPIP1[134-327] oraz wykazanie międzyłańcuchowej koordynacji jonów cynku pomiędzy dwoma monomerami tego białka za pomocą metod biochemicznych oraz biofizycznych.Analiza krystalograficzna struktury MCPIP1[134-327] oraz analiza oddziaływania wewnątrzcząsteczkowego i koordynacji metalu potwierdziły międzyłańcuchowe wiązanie jonów cynku w krystalicznej strukturze dimeru MCPIP1[134-327]. Na podstawie struktury kryształu wybrano 3 konstrukty białka MCPIP1, stanowiące podstawę dalszych badań: kontrolę, niezawierającą palca cynkowego (D134-L297), fragment zawierający miejsce międzycząsteczkowego wiązania cynku (D134-G315) oraz wariant posiadający dodatkowo pełny motyw palca cynkowego (D134-S327). Wyniki analizy termostabilności białek MCPIP1 dla różnych stężeń cynku za pomocą metody DSF oraz nanoDSF wskazały na największą stabilność fragmentu D134-G315. Z kolei analiza powinowactwa białek MCPIP1 do oligonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie wykazała znacznie słabsze powinowactwo MCPIP1 D134-G315 do substratu w porównaniu z pozostałymi białkami. Badania widm dichroizmu kołowego fragmentów MCPIP1 pozwoliło na określenie zawartości struktur drugorzędowych, które pozostają w dużej zgodności ze strukturą krystaliczną. Jednakże analizy dichroizmu kołowego nie wykazały istotnych zmian strukturalnych wywołanych obecnością jonów cynku w roztworze. Uzyskane wyniki sugerują, że międzyłańcuchowe wiązanie jonów cynku w dimerze MCPIP1[134-327] może być indukowane obecnością substratu. W przypadku braku substratu jony cynku mogą być wiązane przez palec cynkowy, czyniąc je dostępnymi w określonych warunkach dla międzyłańcuchowego wiązania stabilizującego dimeryzację PIN MCPIP1[134-327].

The MCPIP1 protein is a negative regulator of inflammation, that prevents its pathological development. Its RNase activity is mainly responsible for the degradation of the mRNA of pro inflammatory cytokines. The most important domains in the MCPIP1 protein are the PIN domain, responsible for RNase activity, and the CCCH zinc finger motif, whose role is to recognize and bind nucleic acids. Apart from the structure of the PIN domain, the structure of the MCPIP1 protein is poorly known because of the structural dynamics of the remaining fragments.The crystal structure of the MCPIP1[134-327] protein solved by Dr. Wilamowski revealed zinc-induced dimerization of the PIN domain, which is an interesting and rarely occurred in nature mechanism of molecular assembly. The aim of the study was to investigate the molecular structure of the dimer of MCPIP1[134-327] protein and to prove occurrence of the interchain coordination of zinc ions between two monomers of this protein using biochemical and biophysical assays.Crystallographic analysis of the MCPIP1[134-327] structure combined with analysis of intramolecular interactions and metal coordination confirmed the interchain binding of zinc ions in the crystal structure of the MCPIP1[134-327] dimer. Based on the crystal structure, three constructs of the MCPIP1 protein were selected for further testing, control one, without zinc finger motif (D134-L297), fragment comprising the intermolecular zinc binding site (D134-G315) and variant additionally containing full zinc finger motif (D134-S327). The results of the thermostability analysis of MCPIP1 proteins in a gradient of zinc concentration using the DSF and nanoDSF methods indicated the highest stability of the MCPIP1 D134-G315 protein. In turn, the analysis of the affinity of MCPIP1 proteins for fluorescently labeled oligonucleotides showed a much weaker affinity of MCPIP1 D134-G315 for the substrate compared to the other proteins. Examination of the circular dichroism spectra of MCPIP1 fragments allowed for the determination of the content of secondary structures, which are in good agreement with the crystal structure. However, circular dichroism analysis did not reveal significant structural changes caused by the presence of zinc ions in the solution.The obtained results suggested that the interchain binding of zinc ions in the MCPIP1[134-327] dimer may be substrate-induced. In the absence of substrate, zinc ions might be bound by the zinc finger motif, making them available in certain conditions for interchain binding that stabilizes the dimerization of the PIN domains of MCPIP1[134-327].