Purification and testing of the activity and stability of peroxin 5 from Trypanosoma cruzi

Ludzka trypanosomoza amerykańska to pasożytnicza choroba, stanowiąca poważny problem w krajach Ameryki Południowej i Środkowej. Jest wywoływana przez pierwotniaka Trypanosoma cruzi, dla którego jedynym źródłem energii jest rozkład glukozy prowadzony w glikosomach. W transporcie enzymów glikolitycznych (zawierających sygnał PTS1) przez błonę organelli zaangażowane są białka zwane peroksynami (PEX). Stworzenie kompleksu PEX5-PEX14 jest niezbędne do translokacji białek do wnętrza glikosomów, dlatego zahamowanie oddziaływania peroksyn stało się jednym ze sposobów walki z chorobą. Celem niniejszej pracy licencjackiej była ekspresja i oczyszczenie peroksyny 5 z Trypanosoma cruzi (tcPEX5) oraz zbadanie jej aktywności i stabilności. W pracy udało się uzyskać wysokiej jakości materiał, który oczyszczano za pomocą chromatografii powinowactwa oraz techniki filtracji żelowej. Stałą dysocjacji pomiędzy tcPEX5, a PTS1 potwierdzającą funkcjonalność rekombinowanego białka wyznaczono posługując się testem polaryzacji fluorescencji (FP), a stabilność termiczną scharakteryzowano przy użyciu Tycho NT.6. W oparciu o uzyskane wyniki obiecujące wydaje się celowanie w oddziaływanie PEX5-PTS1, które przyczyniłoby się do zahamowania transportu enzymów do wnętrza glikosomów, a tym samym do śmierci pasożytów.

Human American trypanosomiasis is a parasitic disease, a serious problem in the countries of South and Central America. It is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, for which the only source of energy is glucose metabolism carried in glycosomes. The transport of glycolytic enzymes (containing the PTS1 signal) through the organelle membrane involves proteins called peroxins (PEX). The creation of the PEX5-PEX14 complex is necessary for the translocation of proteins into the interior of glycosomes, therefore inhibition of peroxin activity has become one of the ways to fight with the disease. The aim of this BA thesis was to express and purify peroxin 5 from Trypanosoma cruzi (tcPEX5), and to study its activity and stability. The work achieved a high quality material that was purified by affinity chromatography, and size exclusion chromatography. The dissociation constant between tcPEX5 and PTS1, confirming the functionality of the recombinant protein was determined using the fluorescence polarization test (FP). The thermal stability was characterized using Tycho NT.6. Based on the obtained results, it seems promising to interfere with the interaction of PEX5-PTS1, which could inhibit the transport of enzymes to the interior of glycosomes and cause the death of parasites.