Effects of CXC chemokines and interferon gamma on activity of carp granulocytes.

Neutrofile ryb, podobnie jak ssaków, stanowią istotną linię obrony organizmu przed patogenami. Komórki te posiadają zdolność do fagocytozy, degranulacji, wybuchu tlenowego oraz tworzenia sieci NET. U ssaków wszystkie te typy aktywności leukocytów regulowane są przez cytokiny, w tym chemokiny i interferony. Celem obecnej pracy było poznanie wpływu in vitro rekombinowanych białek: chemokin z rodziny CXC (CXCa_L1, CXCL8_L2, CXCb1) oraz interferonu gamma (IFN-γ2) na aktywność bójczą granulocytów karpia. Dodatkowo, zbadano wpływ czasu inkubacji komórek oraz ich stymulacji lipopolisacharydem (LPS) i estrem forbolu (PMA). Granulocyty wyizolowane z nerki głowowej karpia inkubowano z pożywką hodowlaną (komórki kontrolne) bądź z rekombinowanymi białkami przez 90 minut lub 18 godzin. Część komórek dodatkowo traktowano LPS lub PMA (90 min). Po tym czasie w komórkach sprawdzano poziom wydzielonego DNA (wyznacznik tworzenia NET), produkcję wolnych rodników tlenowych (ROS) i tlenku azotu (NO). Stwierdzono stymulujący wpływ LPS i PMA na tworzenie sieci NET oraz podniesienie produkcji ROS i NO, odpowiednio w komórkach stymulowanych PMA i LPS. Zauważono ponadto, że wydłużenie czasu inkubacji komórek in vitro zwiększa wydzielanie zewnątrzkomórkowego DNA, ale osłabia stymulowany PMA wybuch tlenowy. Równocześnie zaobserwowano, że chemokiny CXC podnoszą poziom wydzielonego DNA w komórkach dodatkowo traktowanych PMA. Z kolei potraktowanie neutrofili karpia rekombinowanym IFN-γ2 osłabia tworzenie sieci NET w komórkach kontrolnych przy równoczesnej stymulacji w tych komórkach produkcji ROS (90 min i 18 h stymulacji IFN) i NO (18 h stymulacji). IFN-γ2 stymuluje także produkcję ROS i NO w neutrofilach dodatkowo traktowanych LPS.Podsumowując, można stwierdzić, że chemokiny CXC i IFN-γ2 modulują aktywność neutrofili karpia, a kierunek tej modulacji zależy od rodzaju białka, jego stężenia, czasu inkubacji komórek oraz ich dodatkowej stymulacji.

Both, in mammals and in fish, neutrophils are an important line of defense against many pathogens. Neutrophils have ability to phagocytosis, degranulation, respiratory burst and they can release extracellular traps- NETs. In mammals, all of these types of leucocyte activity are regulated by the cytokines, including interferons and chemokines. The aim of present research was to investigate the in vitro effect of recombinant proteins: CXC chemokines (CXCa_L1, CXCL8_L2, CXCb1) and interferon gamma (IFN-γ2) on the activity of the common carp granulocytes. In addition, the effects of time of cell incubation and their stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and phorbol ester (PMA) was investigated. Head kidney granulocytes were incubated with culture medium (control cells) or with recombinant proteins for 90 minutes or 18 hours. Some of these cells were treated with LPS or PMA (90 minutes). After stimulation, the level of the extracellular DNA (NET formation marker) and production of reactive oxygen species (ROS) or nitric oxide (NO) were measured. Stimulation of the granulocytes with LPS and PMA increased the NET formation, ROS and NO production in cells stimulated with PMA and LPS, respectively. Furthermore, it was found that prolonged time of cells incubation in vitro stimulated the secretion of extracellular DNA, but decreased the respiratory burst stimulated by PMA. Moreover, cells treated with CXC chemokines and PMA formed the extracellular DNA. Incubation of neutrophils with recombinant IFN-γ2 significantly reduced NET formation in the control cells and stimulated production of ROS (90 min and 18 h incubation) and NO (18 h incubation). IFN-γ2 also increased the production of ROS and NO in LPS-treated neutrophils.In summary, it can be concluded that CXC chemokines and IFN-γ2 modulate the activity of carp neutrophils, and the direction of this modulation depends on the type of protein, its concentration, time of cell incubation and their additional stimulation.