In vivo labeling and flow cytometry analysis reveal new subsets of bone marrow endothelial cells in mice

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) zapewniają produkcję komórek krwi przez okres całego naszego życia. Proces hematopoezy przebiega w wyspecjalizowanym mikrośrodowisku szpiku kostnego, zwanym niszą szpikową. W obrębie niszy szpikowej można wyróżnić dwa główne obszary - niszę śródkostną (ang. endosteal niche) oraz niszę przynaczyniową (ang. perivascular niche). We wcześniejszych badaniach poprzez zastosowanie szeregu markerów powierzchniowych definiujących komórki HSCs, określono ich lokalizację w pobliżu niszy przynaczyniowej, Mimo wielu badań analizujących heterogenność niszy szpikowej, nie jest znana subpopulacja komórek śródbłonkowych (ang. endothelial cells, EC) odpowiedzialna za prawidłowe funkcjonowanie komórek HSCs. Celem tej pracy jest prospektywna identyfikacja frakcji komórek ECs pochodzących ze szpiku kostnego z użyciem cytometrii przepływowej.Ponieważ wraz ze starzeniem się organizmu zachodzą zmiany w obrębie niszy, zbadano myszy w dwóch przedziałach wiekowych. Myszom dożylnie podano przeciwciało anty-VECad, APC (12,5 μg/mysz) oraz frakcję przeciwciał IgG, PE TexasRed (12,5 μg/mysz). Po wyizolowaniu kości udowych i piszczelowych i potraktowaniu ich enzymami trawiącymi, komórki wybarwiono z użyciem przeciwciał monoklonalnych rozpoznających antygeny: Sca-1, CD45, Ter119, CD140 oraz Ly6C.Przeprowadzona analiza cytometryczna wykryła różnice w ekspresji genów FcγR2b oraz Ly6c1. Biorąc pod uwagę obecność receptorów FcγR oraz ekspresję Ly6C pośród komórek śródbłonkowych wyróżniono trzy różne populacje komórkowe. Zaobserwowano również różny skład procentowy komórek Ly6C+IgG+ w zależności od wieku myszy. Podsumowując, w pracy przedstawiono metodę prospektywnej identyfikacji różnych frakcji komórek śródbłonkowych budujących niszę szpikową. Wykorzystując cytometrię przepływową oraz ekspresję Ly6C i wiązanie przeciwciał IgG opracowano nową metodę analizy heterogenności komórek śródbłonka w niszy szpikowej.

Hematopoietic stem cells (HSCs) support the production of blood cells thought whole our life. Process of hematopoiesis takes place in bone marrow, in specialized microenvironment called bone marrow niche. The niche is composed of endosteal niche and perivascular niche. Defining HSCs by several surface markers allowed to characterize their localization in close proximity to perivascular niche. However it is not clear which subpopulation of endothelial cells supports proper function of HSCs. Therefore aim of this study is to prospectively identify different fractions of endothelial cells building bone marrow niche using flow cytometry.Because of changes in composition of the niche occurring with the age, mice in two age ranges were studied. Firstly mice were intravenously injected with anti-VECad, APC-conjugated antibody (12,5 μg) and fraction of PE TexasRed-conjugated IgG, (12,5 μg). After bone isolation and treatment with enzymes, cells were stained with monoclonal antibodies detecting: Sca-1, CD45, Ter119, CD140 and Ly6C.Performed analysis revealed differences in expression of FcγR2b and Ly6c1 genes. Basing on the presence of FcγR receptors on cell surface and the expression of Ly6C, endothelial cells were divided into three different populations. Interestingly number of Ly6C+IgG+ cell population showed differences in number between young and old mice.Concluding, this work presents method of prospective identification of different populations building bone marrow niche. Applying flow cytometry method and using the expression of Ly6C and staining cells with IgG antibody allowed to analyze heterogeneity of endothelial cells building bone marrow niche.