Study of intranuclear foci formation of DNA double-strand breaks repair factors in low oxygen concentration

Obniżone stężenie tlenu ma wpływ na wiele różnych procesów komórkowych. Niedotlenienie może powodować niestabilność genetyczną na skutek zaburzenia wielu mechanizmów naprawczych DNA. Ostry stres hipoksyczny szybko stymuluje zmiany w ścieżkach naprawy uszkodzeń DNA poprzez modyfikacje potranslacyjne białek.Jedną z najwcześniejszych konsekwencji powstania dwuniciowego pęknięcia DNA jest aktywacja kinazy ATM, a następnie fosforylacja histonu H2AX. Fosforylacja H2AX następuje już w ciągu minut po uszkodzeniu i bardzo szybko rozciąga się na wiele par zasad, stanowiąc sygnał do rekrutacji kolejnych białek naprawczych.Przedmiotem badań niniejszej pracy było zbadanie wpływu obniżonego stężenia tlenu na formowanie wewnątrzjądrowych ognisk czynników naprawy dwuniciowych pęknięć DNA w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA. Wykonano lokalne uszkadzanie DNA za pomocą światła niebieskiego (linia 488 nm) lasera argonowego w warunkach równowagi z powietrzem oraz w warunkach obniżonego stężenia tlenu. Zastosowano dwie metody obniżania stężenia tlenu: poprzez ograniczenie dyfuzji tlenu oraz poprzez zwiększenie liczby komórek w pożywce i potwierdzono ich skuteczność. Wykazano iż, fosforylacja histonu H2AX w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA jest zaburzona w warunkach obniżonego stężenia tlenu. Odkryto, iż obniżone stężenie tlenu powoduje upośledzenie aktywacji kinazy ATM w odpowiedzi na uszkodzenia DNA.

The conditions of reduced oxygen concentration affect many different cellular processes. Hypoxia can cause genetic instability due to the disruption of many DNA damage repair pathways. Acute hypoxic stress quickly stimulates changes in DNA damage repair pathways through post-translational modifications of proteins.One of the earliest consequences of the formation of double-strand DNA breaks is the activation of ATM kinase, followed by H2AX histone phosphorylation. H2AX phosphorylation occurs within minutes after DNA damage and very quickly extends over long distances, as a signal for recruitment of subsequent repair proteins.The aim of the this study was to investigate the effect of low oxygen concentration on the formation of intranuclear foci of DNA double strand breaks repair agents at the site of local DNA damage. Local DNA damage was induced using blue light (488 nm line) of an argon laser in normoxia and under conditions of reduced oxygen concentration.Two methods of reducing oxygen concentration were used: by limiting oxygen diffusion or by increasing the number of cells in the sample. Effectiveness of both methods was confirmed. It has been shown that phosphorylation of H2AX histone at the site of local DNA damage is impaired under low oxygen concentration. It was also found that reduced oxygen concentration causes impairment of ATM kinase activation in response to DNA damage.