New therapeutic strategy employing Bcl-2 inhibitors as active agents against acute pancreatitis: in vivo studies in a cerulein-induced model of acute pancreatitis in mice

Ostre zapalenie trzustki (OZT) jest chorobą zapalaną charakteryzującą się wystąpieniem obrzęku, nekrozy komórek pęcherzykowych oraz infiltracją komórek układu odpornościowego. Ze względu na brak skutecznej metody leczenia OZT, obecna strategia terapeutyczna polega głównie na łagodzeniu objawów bólowych oraz podawaniu prewencyjnej antybiotykoterapii. Wieloletnie badania i obserwacje kliniczne wykazały, że w ciężkim przebiegu ostrego zapalenia trzustki przeważa śmierć nekrotyczna komórek pęcherzykowych, przy stosunkowo niewielkiej ilości komórek apoptotycznych. Z kolei w łagodnym przebiegu OZT, proporcja ta odwraca w kierunku śmierci apoptotycznej. W związku z tym, promowanie śmierci apoptotycznej komórek pęcherzykowych może prowadzić do zmniejszenia powierzchni obszarów martwiczych i okazać się kluczowym podejściem terapeutycznym w leczeniu OZT.W niniejszej pracy zbadano wpływ wybranych inhibitorów białek z rodziny Bcl-2 (navitoclax i venetoclax) na regulację śmierci komórek pęcherzykowych oraz przebieg ostrego zapalenia trzustki. W tym celu 36 myszy szczepu C57BL/6J podzielono na 6 grup doświadczalnych. OZT indukowano poprzez siedmiokrotne podanie ceruleiny dootrzewnowo w godzinnych odstępach w dawce 50ug/ml (OZT; n=6, OZT, OZT VEN; n=6, OZT NAVI; n=6). Grupy, u których zastosowano także terapię w celu leczenia OZT otrzymały dodatkowo 100mg/ml navitoclaxu (OZT NAVI; n=6) lub venetoclaxu (OZT VEN; n=6) dootrzewnowo rozpuszczonego w nośniku leku. Dwie grupy otrzymały inhibitory w dawce 100mg/ml bez indukcji stanu zapalnego (NAVI; n=6, VEN; n=6). Ostatnia grupa stanowiła kontrolę i otrzymała sam nośnik leku (CTRL; n=6). Po eutanazji pobrano od zwierząt trzustkę, płuca, serce, wątrobę, śledzionę, nerki oraz krew z zatoki oczodołowej. Oceniono wpływ leków na podstawowe parametry krwi oraz masy organów pobranych od zwierząt doświadczalnych. W celu oceny wpływu navitoclaxu i venetoclaxu na regulację śmierci komórek pęcherzykowych trzustki wykonano barwienie immunohistochemiczne przeciwko aktywowanej kaspazie-3. Analiza histologiczna umożliwiła ocenę przebiegu ostrego zapalenia trzustki. W celu zbadania zmian w ekspresji genów białek z rodziny Bcl-2 wyizolowano RNA z trzustek zwierząt z grupy kontrolnej oraz z grupy, w której indukowano ostre zapalenie trzustki. Otrzymane wyniki sugerują, że zastosowane inhibitory białek z rodziny Bcl-2 prowadzą do złagodzenia przebiegu ostrego zapalenia trzustki, a ich podanie skutkuje zmniejszeniem powierzchni obszarów nekrotycznych. Zarówno podanie navitoclaxu, jak i venetoclaxu prowadzi do przesunięcia równowagi w kierunku śmierci apoptotycznej komórek pęcherzykowych. Venetoclax przyczynia się do całkowitej redukcji martwicy tkanki tłuszczowej, znacznie obniża martwicę miąższu trzustki oraz wywołuje mniejszy stopień apoptozy w zdrowej tkance w porównaniu do navitoclaxu. Jednocześnie, ze względu na niskie powinowactwo do białka Bcl-xL, nie prowadzi do rozwoju trombocytopenii.

Acute pancreatitis (AP) is an inflammatory disorder predominantly associated with the exocrine pancreas. It is characterized by edema, infiltration of immune cells and necrosis of pancreatic acinar cells. Since no effective therapy against AP currently exists, the treatment is based on administration of preventative antibiotics and anti-pain medication.Previous studies have shown that severe AP correlates with extensive necrosis of pancreatic acinar cells (PAC), but there is only very little apoptosis present. In mild AP, this proportion of cell death is reversed. Therefore, sensitization of PAC to apoptotic death was postulated to reduce acinar necrosis and the severity of pancreatitis.In this project, we investigated the effect of two Bcl-2 inhibitors (navitoclax and venetoclax) on acinar cell death regulation and the severity of acute pancreatitis. To achieve that we used 36 C57BL/6J mice, assigned to 6 groups. Acute pancreatitis was induced by intraperitoneal administration of 50 µg/ml cerulein, seven times at hourly intervals (OZT; n=6). Treatment groups received 100 mg/ml of navitoclax (OZT NAVI; n=6) or venetoclax (OZT VEN; n=6) intraperitoneally, dissolved in a drug vehicle. Drug control groups were treated with navitoclax or venetoclax without subsequent induction of AP (NAVI; n=6, VEN; n=6). Control group received the drug vehicle intraperitoneally (CTRL; n=6). At the end of the experiment, the mice were euthanized and the pancreas, lungs, heart, liver, spleen and kidneys were harvested from mice. Blood samples were collected from orbital sinuses. The effects of the drugs on the basic blood parameters and the organ mass were analyzed. In order to evaluate the impact of navitoclax and venetoclax on apoptosis induction in PSC, immunohistochemical staining against cleaved caspase-3 was carried out. The severity of acute pancreatitis was assessed by histological scoring. Differences in the expression of selected Bcl-2 family members between control and acute pancreatitis groups were investigated at the mRNA level.In conclusion, our results show that administration of Bcl-2 inhibitors in acute pancreatitis leads to a less severe course of inflammation and a significant reduction of pancreatic necrosis. Both navitoclax and venetoclax shift the balance of PAC cell death from necrosis towards apoptosis. Venetoclax caused almost a complete reduction in adipose tissue necrosis, and a more substantial decrease in parenchymal necrosis as well as apoptotic death rate compared to navitoclax. Since venetoclax does not induce thrombocytopenia (likely due to its low affinity to Bcl-xL), this drug could potentially find its application in the treatment of AP.