Identification and characterization of proteins interacting with ZFP819, a novel pluripotency-specific protein.

Pluripotentne komórki macierzyste stanowią obiecujące narzędzie przyszłej medycyny regeneracyjnej z uwagi na ich szeroki potencjał różnicowania. Jednakże próby kliniczne z wykorzystaniem pluripotentnych komórek macierzystych wymagają bliższego poznania mechanizmów regulujących pluripotencję. Dlatego też celem niniejszej pracy było przybliżenie funkcji ZFP819 w komórkach macierzystych poprzez zastosowanie drożdżowego systemu dwuhybrydowego jako efektywnej metody badania interakcji międzycząsteczkowych. ZFP819 należy do rodziny czynników transkrypcyjnych, zdolnych regulować transkrypcję określonych genów poprzez domenę KRAB i motwy palców cynkowych. W wyniku drożdżowego systemu dwuhybrydowego zidentyfikowano wiele potencjalnych partnerów interakcji, spośród których największą zainteresowanie skierowano na czynniki zaangażowane w utrzymywanie integralności genomowej m. in. Chd4 i Ctc1. Szczególną uwagę poświęcono genowi H3f3b, który koduje zastępczy wariant histonu 3, preferencyjnie wbudowywany do chromatyny telomerowej embrionalnych komórek macierzystych. Badanie kolokalizacji oraz inne metody weryfikujące oddziaływania międzycząsteczkowe, tj. bezpośredni drożdżowy system dwuhybrydowy oraz Proximity Ligation Assay (PLA), potwierdziły pierwotnie otrzymane wyniki. Ponad to, według licznych danych literaturowych, istotnym czynnikiem modulującym funkcję wielu czynników transkrypcyjnych jest KAP1 – białko oddziaływujące z domeną KRAB i stanowiące niejako rusztowanie dla innych czynników modelujących chromatynę. Asocjacja ZFP819 z CHD4 i CTC1 zaangażowanymi kolejno w naprawę uszkodzeń DNA i strukturę telomerów, umacnia potencjalną rolę ZFP819 w utrzymywaniu integralności genomowej pluripotencjalnych komórek macierzystych. Dodatkowo, poszukiwania sygnału lokalizacji jądrowej ujawniły obecność nietypowej sekwencji, odpowiedzialnej za translokację ZFP819 do jądra komórkowego. Jednakże dalsze badania poszczególnych domen palców cynkowych wydają się niezbędne, w celu potwierdzenia lokalizacji jądrowej sekwencji sygnałowej. W oparciu o uzyskane wyniki można wnioskować, że ZFP819 odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu pluripotencji komórek macierzystych, poprzez stabilizację odpowiedniej struktury chromatyny. Dalsze badania zgłębiające rolę zarówno ZFP819 jak i innych nieznanych jak dotąd czynników wpływających na mechanizmy kierujące pluripotencją, wydają się być kluczowe do pełnego poznania biologii komórek macierzystych.

Pluripotent stem cells constitute a very promising tool for regenerative medicine applications due to their differentiation potential. However, prior to any clinical applications, mechanisms governing pluripotency require further clarification. Therefore this study aimed at elucidation the function of novel pluriopotency-related protein – ZFP819 by taking advantage of yeast-two-hybrid (Y2H) assay, the most powerful and reliable method to disclose the function of unknown factors via dicovery of protein-protein interactions. ZFP819 belongs to the KRAB-ZNF protein family therefore is considered to function as a transcription factor in order to modulate the expression profile. Y2H experiment revealed many candidate interacting genes involved in maintenance of ES cells genomic integrity i.e. Chd4, Ctc1, however the great attention has been directed towards H3f3b – the replacement variant of histone 3, preferentially incorporated into the telomeric chromatin of ES cells. We were able to demonstrate the co-localiztion of ZFP819 and H3F3B in the nuclei of ES cells and confirm the interaction by direct yeast-two-hybrid and proximity ligation assay. Additional considerations have been dedicated to KAP1 as a major scaffold protein which might mediate the chromatin remodeling executed by most of KRAB-ZNF proteins in pluripotent stem cells. Furthermore, the interaction with other epigenetic factors like CHD4 and CTC1 involved in DNA damage repair and telomere chromatin structure, respectively, strongly supports the function of ZFP819 in maintenance of genomic integrity. Moreover, the nuclear localization signal of ZFP819 has been investigated and the non-canonical consensus has been identified within the ZFP819 sequence. Therefore, further studies are pivotal in order to examined individual zinc fingers present in N-terminal end of the ZFP819. Taken together, we propose that ZFP819 may strongly affect the pluripotency network in order to regulate the chromatin assembly in spatial and temporal dependent manner. However further studies are essential for understanding the role of ZFP819 and other unknown factors in order to broaden our knowledge about mechanisms governing pluripotency.