Evaluation of the development of cutaneous infection induced by Staphylococcus aureus in neutropenic mice

Szczególna rola neutrofili, związana jest z ich zdolnością do uśmiercania patogenów chorobotwórczych poprzez różnorodne mechanizmy. Rekrutacja neutrofili z krążenia w miejsce infekcji stanowi wyznacznik prawidłowej odpowiedzi przeciwbakteryjnej, a spadek poziomu neutrofili, określany jako neutropenia predysponuje do infekcji. Jednym z najczęstszych miejsc infekcji bakteryjnych u pacjentów z neutropenią jest skóra, a infekcje te często powodowane są przez bakterie gatunku Staphylococcus aureus. Problem w leczeniu zakażeń gronkowcowych, wynika z występowania szczepów lekoopornych oraz zdolnych do produkcji licznych czynników wirulencji. Dlatego celem niniejszej pracy była analiza wpływu obniżonego poziomu neutrofili na rozwój infekcji skórnej wywołanej przez bakterie S. aureus w modelu mysim. Celem obniżenia poziomu neutrofili myszy poddano iniekcji przeciwciałami anty-Ly6G, a infekcję wywołano poprzez powierzchniowe nacięcia na skórze myszy oraz podanie szczepu bakterii S. aureus USA300 JE2 w dawce 2x106 CFUs (ang. colony forming units). Analiza rozwoju infekcji wykonana poprzez ocenę liczby bakterii w zakażonej tkance metodą manualną i automatyczną, nie wykazała wpływu obniżonego poziomu neutrofilii na wzrost bakterii oraz ich morfologię. Pogłębiona analiza qPCR ekspresji genów czynników wirulencji gronkowca, wykazała obniżenie mRNA g-hemolizyny A oraz stafyloksantyny w wyniku spadku neutrofili. Ocena zakażonej tkanki in vivo, ukazała gorszy obraz przebiegu gojenia rany u myszy neutropenicznych, przy czym analiza histologiczna nie wykazała różnic w nacieku leukocytów do miejsca infekcji względem myszy kontrolnych. Analiza biochemiczna wykazała tendencję spadkową aktywności MPO w procesie chlorynacji, przy braku różnic w aktywności elastazy. Szczegółowa analiza qPCR ekspresji genów w skórze, wykazała fenotyp prozapalny u myszy neutropeniczych, z istotnie podwyższonymi poziomami mRNA IL-6, IL-1b, TNF, IFN-g, co wskazuje na kompensację spadku neutrofili wzmożoną odpowiedzią cytokinową, z dodatkowym wzrostem CXCL2, Mmp9, ważnych dla ich rekrutacji. Co ciekawe, wykazano działanie immunomodulacyjne obniżonego poziomu neutrofili, wpływające na wzrost ekspresji genu markera populacji makrofagów M2 (Ym1), wraz ze wzrostem charakterystycznych dla M2 cytokin IL-10 oraz TGF-b. Wyniki te dostarczają szczegółowej wiedzy na temat wpływu obniżonego poziomu neutrofili na przebieg infekcji naskórka przez bakterie S. aureus u myszy i w przyszłości powinny być kontynuowane na liczniejszej grupie myszy oraz z zastosowaniem dodatkowych grup kontrolnych.

The special role of neutrophils is related to their ability to kill pathogens through various mechanisms. Recruitment of neutrophils from the circulation to the site of infection is an indicator of a proper antibacterial response, and a decrease in the level of neutrophils, referred as neutropenia, predisposes to infection. One of the most frequent site of bacterial infections in neutropenic patients is skin. Those infections are often difficult to defeat especially when induced by Staphylococcus aureus. Recently, the urgent clinical problem is the presence of multi-drug resistant strains, which produce numerous virulence factors. Therefore, the aim of this study was to analyze the effect of neutrophil depletion on the development of skin infection caused by S. aureus in a mouse model. To reduce the level of neutrophils, mice were injected with anti-Ly6G antibodies and the cutaneous infection was induced through superficial incisions in the skin, followed by administration of the S. aureus USA300 JE2 strain (2x106 CFUs). The analysis of the number of bacteria in the infected tissue was performed with the manual and automatic methods, which showed no effect of neutrophil depletion on the morphology and growth of bacteria. An in-depth qPCR analysis of the gene expression of staphylococcal virulence factors showed a decrease in the mRNA level of the g-hemolysin A and the staphyloxanthine as a result of a neutrophil depletion. In vivo evaluation of the infected tissue showed a deterioration of wound healing process in neutropenic mice, while histological analysis revealed no difference in leukocyte infiltration to the site of infection compared to control mice. Biochemical analysis indicated the decrease of MPO activity in the chlorination process, with no differences in elastase activity. Detailed qPCR analysis of gene expression in the skin revealed a pro-inflammatory phenotype of neutropenic mice, with significantly elevated levels of IL-6, IL-1b, TNF, IFN-g mRNA. Such profile indicates compensation of the neutrophil depletion by an enhanced cytokine response, along with increase in CXCL2, Mmp9, mediators important for neutrophil recruitment. Interestingly, the immunomodulatory effect of the neutrophil depletion has been demonstrated, resulting in increased level of Ym1, the marker of the M2 macrophage polarization. The result corroborates with the increase of IL-10 and TGF-b, cytokines characteristic for M2. These results provide a more detailed understanding of the effect of neutrophil depletion on the course of cutaneous S. aureus infection in mice model and should be continued in the future in a larger group of mice with additional control groups.