Characteristics of CD4+ cell N-glycans in Hashimoto's thyroiditis

Choroba Hashimoto (HT) jest chorobą autoimmunologiczną charakteryzującą się przewlekłym stanem zapalnym tarczycy. Choroba ta powoduje utratę tolerancji immunologicznej na antygeny tarczycy, co powoduje zniszczenie tyreocytów przez aktywowane limfocyty T i niedoczynność tarczycy. Najbardziej zróżnicowaną grupą limfocytów T, wykazującą ekspresję koreceptora CD4, są limfocyty T pomocnicze (Th), określane również jako limfocyty T CD4+. Uczestniczą one w stymulowaniu dojrzewania limfocytów B do plazmocytów bądź komórek B pamięci. W obrębie limfocytów Th wyróżniamy subpopulacje Th1, Th2, Th9, Th17 oraz Treg. Większość receptorów limfocytów T ulega N-glikozylacji, czyli modyfikacji potranslacyjnej białek polegającej na enzymatycznym przyłączeniu reszt cukrowych do asparaginy w określonej sekwencji aminokwasowej. Stwierdzono, że N-glikozylacja ulega zmianie w reakcji zapalnej oraz chorobach autoimmunologicznych. Celem badań była ocena zmian N-glikozylacji limfocytów T CD4+ w HT w odniesieniu do zdrowych dawców. Do badań wykorzystano próbki krwi pobrane od dawców z podwyższonym poziomem przeciwciał przeciwko tyreoperoksydazie (anty-TPO) i/lub przeciwko tyreoglobulinie (anty-Tg) oraz TSH w normie (HT1, n=14), pacjentów z chorobą Hashimoto z ustabilizowanym stężeniem TSH w skutek leczenia L-tyroksyną (HT2, n=26) (grupy badane) oraz zdrowych dawców (CTR, grupa kontrolna) (n=18). Limfocyty T CD4+ wyizolowano z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu magnetycznego sortera autoMACS Pro Separator. N-glikany uwolniono z białek CD4+ przez trawienie N-glikozydazą F i analizowano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w normalnym układzie faz (NP-HPLC) po znakowaniu fluorescencyjnym kwasem 2-aminobenzoesowym (2-AA). Chromatogramy NP-HPLC zintegrowano uzyskując 30 pików (GP). Adnotację GP N-glikanów przeprowadzono na podstawie wartości jednostek glukozy (GU) w oparciu o bazę danych GlycoStore (glycostore.org). Do analizy wyników użyto test Kruskala-Wallisa przyjmując istotność statystyczną dla p<0,05. Wyniki wykazały statystycznie istotne różnice w zawartości N-glikanów limfocytów CD4+ między HT i CTR. Zawartość N-oligosacharydów typu złożonego o strukturze diantenowej, w większości z rdzeniową fukozą, a część z przedzielającą N- acetyloglukozoaminą, ulega zmniejszeniu głównie w grupie HT1 (GP8, 10, 11, 12, 14, 17 i 19) i jednym przypadku również u dawców HT2 (GP11). Podwyższony poziom sjalowanych diantennarnych N-glikanów typu złożonego (GP22) stwierdzono w grupie HT1 w porównaniu do zdrowych dawców. Wzrost zawartości struktur oligosacharydowych w HT1 w porównaniu do kontroli wykazano również w GP24, 25 i 30, lecz dla znacznika 2-AA w bazie GlycoStore stuktura N-oligosacharydów nie była dostępna. Skład monosacharydowy N-glikanów zweryfikowano stosując sekwencyjne trawienie egzoglikozydazami. Przesuniecie GP obserwowano po zastosowaniu (1-3,4)-galaktozydazy, (1-2,3,4,6)-fukozydazy, -N-acetyloheksozaminidazy i (1-2,3,6)-mannozydazy, co potwierdza obecność w N-glikanach odpowiednio reszt galaktozy, fukozy, N-acetyloglukozoaminy oraz mannozy. Wykryte zmiany w N-glikozylacji limfocytów T CD4+ mogą mieć znaczenie dla chronicznego zapalenia w tkance tarczycy chorych z HT, w którym pośredniczą te komórki.

Hashimoto's thyroiditis (HT) is an autoimmune disease characterized by chronic inflammation of the thyroid gland. This disease causes a loss of immune tolerance to thyroid antigens, resulting in destruction of thyrocytes by activated T cells and hypothyroidism. The most diverse group of T cells expressing the CD4 coreceptor are T helper (Th) cells, also referred to CD4+ T cells. They stimulate the maturation of B lymphocytes into plasmocytes or memory B cells. Within Th lymphocytes there are Th1, Th2, Th9, Th17 and Treg subpopulations. Most T lymphocyte receptors undergo N-glycosylation, post-translational modification of proteins by enzymatic attachment of sugar residues to asparagine in a given sequence. N-glycosylation has been found to be altered in inflammation and autoimmune diseases. The aim of the study was to evaluate the changes in N-glycosylation of CD4+ T cells in HT compared to healthy donors. Blood samples were taken from the donors with the elevated levels of anti-TPO and/or anti-Tg and normal TSH concentration (HT1 group, n=14), HT patients after stabilization of TSH level due to L-thyroxine supplementation (HT2, n=26) (study groups) and healthy donors (CTR, control group, n=18). CD4+ T cells were isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the autoMACS Pro Separator magnetic sorter. N-glycans were released from CD4+ proteins by N-glycosidase F digestion and analyzed by normal phase high performance liquid chromatography (NP-HPLC) after fluorescence labeling with 2-aminobenzoic acid (2-AA). NP-HPLC chromatograms were integrated into 30 peaks (GP). N-glycan GP annotation was performed on the basis of glucose units (GU) values based on the GlycoStore database (glycostore.org). Kruskal-Wallis test was used to analyze the results, assuming statistical significance for p<0.05. The results showed statistically significant differences in CD4+ lymphocyte N-glycans between HT and CTR. The content of diantennary complex-type N-oligosaccharides, mostly with core fucose and bisecting N-acetylglucosamine, decreased in the HT1 (GP8, 10, 11, 12, 14, 17 and 19) and HT2 (GP11) donors. The elevated level of sialated diantennary complex-type N-glycans (GP22) were found in the HT1 group compared to healthy volunteers. GP annotation was further checked by analyzing N-oligosaccharides digested with exoglycosidases. The presence of galactose, fucose, N-acetylglucosamine and mannose was confirmed by GP shift after N-glycan digestion by respectively (1-3,4)-galactosidase, (1-2,3,4,6)-fucosidase), -N-acetylhexosaminidase, and (1-2,3,6)-mannosidase. The detected changes in N-glycosylation of CD4+ T cells may play a role in T cell-mediated chronic inflammation in thyroid tissue of HT patients.