The effect of the MAPK signaling pathway on the anti-leukemic activity of the Mcl-1 protein inhibitor.

Opracowanie skutecznej terapii w leczeniu ostrej białaczki szpikowej wciąż stanowi wyzwanie dla współczesnej medycyny. Obecnie naukowcy skupiają się na antyapoptotycznych białkach z rodziny Bcl-2, szukając w nich wyjaśnienia oporności komórek nowotworowych na stosowane terapie. Zsyntetyzowanie S63845, nowego, wysoce selektywnego inhibitora antyapoptotycznego białka Mcl-1, które ulega nadekspresji w ostrej białaczce szpikowej, przyniosło ogromne nadzieje w walce z chorobą. Pierwsze badania wskazują na cytotoksyczne działanie S63845 w komórkach szpiczaka mnogiego, białaczki oraz chłoniaka. Niemniej jednak wciąż nie są dokładnie poznane molekularne mechanizmy zaangażowane w aktywność przeciwbiałaczkową wyżej wymienionego inhibitora. Jak wiadomo szlak kinaz białkowych MAP odgrywa istotną rolę w regulacji ekspresji i aktywności białek z rodziny Bcl-2 i pośrednio może być również zaangażowany w działanie ich inhibitorów. Celem niniejszej pracy było zatem określenie wpływu szlaku sygnałowego MAPK na aktywność przeciwbiałaczkową inhibitora S63845. Badania przeprowadzono na liniach komórkowych dwóch różnych typów ostrej białaczki szpikowej: promielocytowej - HL-60 oraz mieloblastycznej - ML-1. Komórki eksponowano na 24 i 48-godzinne działanie inhibitora kinazy MEK, PD98059, w stężeniu 50 µM oraz inhibitora S63845 w kilku stężeniach, zarówno pojedynczo jak i w skojarzeniu. Za pomocą testu MTT dokonano oceny wpływu badanych związków na żywotność komórek. Zmiany w liczebności komórek określono metodą Coultera. Obserwacji zmian w morfologii komórek pod kątem indukowania w nich procesu apoptozy dokonano w mikroskopie świetlnym, a ekspresję białka Mcl-1 zbadano metodą Western blot. Jak pokazują wyniki badań, PD98059 wpływa na aktywność S63845 powodując nasilenie jego cytotoksycznego działania wobec komórek białaczkowych. Skojarzone działanie inhibitorów spowodowało spadek żywotność i liczebności komórek białaczkowych oraz zwiększyło efektywność indukowania apoptozy. Obserwowany efekt był silniejszy w komórkach HL-60 niż Ml-1, czego przyczyną może być odmienna ekspresja białka Mcl-1 w obu liniach komórkowych. W komórkach ML-1 stwierdzono ekspresję dwóch izoform białka Mcl-1, zarówno Mcl-1L jak i Mcl-1S, a w komórkach HL-60 ekspresji ulegała jedynie izoforma Mcl-1L. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na synergizm działania S63845 z PD98059, a tym samym na znaczącą rolę szlaku MAPK w regulowaniu aktywności przeciwbiałaczkowej inhibitora białka Mcl-1. Co więcej, wyniki skłaniają do prowadzenia dalszych badań w kierunku głębszego poznania mechanizmów działania S63845 w komórkach białaczkowych, a w konsekwencji opracowania skuteczniejszej terapii z jego wykorzystaniem.

Elaboration of the effective therapy in the treatment of acute myeloid leukemia is still a challenge for contemporary medicine. Currently, scientists are focusing on antiapoptotic proteins from the Bcl-2 family to find explanations for the resistance of cancer cells to applied therapies. The synthesis of S63845, a new, highly selective inhibitor of the anti-apoptotic Mcl-1 protein, which is overexpressed in acute myeloid leukemia, has given new perspective to overcome disease. The first studies have indicated the cytotoxic effect of S63845 in multiple myeloma, leukemia and lymphoma cells. However, molecular mechanisms involved in the action of the above-mentioned inhibitor are still scarce. It is known, that MAP protein kinase pathway participates in the regulation of expression and activity of the Bcl-2 family proteins and may also indirectly be involved in the actions of their inhibitors. The aim of this study was to determine the influence of the MAPK signaling pathway on the anti-leukemic activity of S63845. Two different types of acute myeloid leukemia cell lines were used : promyelocytic - HL-60 and myeloblastic - ML-1. The cells were exposed to the action of MEK kinase inhibitor, PD98059, at a concentration of 50 µM and S63845 inhibitor at different concentrations, alone or in combination for 24 and 48 hour. Using the MTT test, the impact of this compounds on cells viability was determined. Changes in the cell number were evaluated using the Coulter method. The induction of apoptosis was investigated by the observation of cell morphology under light microscope. Mcl-1 protein expression in control and treated cells was analyzed by Western blot. The obtained results showed that PD98059 increased the cytotoxic activity of S63845 against leukemia cells. After treatment of leukemia cells with the combination of the inhibitors, a decrease in the viability and the number of leukemia cells and also an increase of apoptosis were found. The observed effects were more pronounced in HL-60 cells than ML-1 cells, what could be explained by a different expression of Mcl-1 protein found in these cell lines. In ML-1 cells the expression of two protein isoforms, Mcl-1L and Mcl-1S was observed while only the Mcl-1L isoform was expressed in HL-60 cells. The results of the present study indicated the synergistic action of S63845 and PD98059 in leukemia cells, and thus the significant role of the MAPK pathway in regulating the anti-leukemic activity of the Mcl-1 protein inhibitor. Moreover, the obtained results lead to further studies on the mechanism of S63845 action in leukemia cells that are important for the development of more effective anticancer therapy.