Analysis of the structure and function of viral proteins : P5 transglycosylase from bacteriophage \phi 6 and human coronavirus nucleocapsid protein NL63

Bibliogr. s. 81-93

Praca koncentruje się wokół charakterystyki strukturalnej i funkcjonalnej wybranych białek wirusowych. Opisane wyniki badań dotyczą transglikozylazy P5 z bakteriofaga ф 6 oraz białka nukleokapsydu (N) ludzkiego α koronawirusa NL63 (HCo NL63). Gospodarzem faga ф 6 jest Pseudomonas syringae, Gram - ujemna bakteria, patogen wielu gatunków roślin uprawnych. Enzym P5 wykazuje aktywność lityczną wobec ściany komórkowej bakterii Gram - ujemnych. Białko P5 zostało wstępnie zaklasyfikowane jako proteaza o potencjalnie nowym mechanizmie katalizy. Później jednak pojawiły się sugestie wskazujące na możliwy mechanizm działania jako litycznej transglikozylazy. Celem badań opisanych w rozprawie było scharakteryzowanie aktywności katalitycznej i mechanizmu działania poprzez połączenie analizy biochemicznej i strukturalnej. Uzyskana struktura krystaliczna jest analogiczna do lizozymu i litycznych transglikozylaz sugerując, że P5 wykazuje jeden z powyższych rodzajów aktywności, a tym samym nie jest zapewne proteazą. Analiza specyficzności substratowej na substratach syntetycznych oraz wyizolowanej ścianie bakteryjnej pozwoliły na identyfikację produktów typowych dla litycznych transglikozylaz. Tym samym wykazano, że P5 nie posiada aktywności proteolitycznej ani lizozymu, a wykazuje aktywność litycznej transglikozylazy. Ukierunkowana mutageneza kluczowych reszt aminokwasowych potwierdziła powyższą konkluzję. Białko P5 poza domeną katalityczną posiada nietypowe wydłużenia N- i C- końców. W pracy wykazano, że część N-końcowa, jak i helisa C-końcowa uczestniczą w regulacji aktywności P5. w przypadku helisy C-końcowej wyjaśniono szczegółowo mechanizm działania poprzez analizę aktywności szeregu mutantów punktowych. Zainteresowanie fizjologią wirusów skłoniło mnie także do podjęcia badań nad białkami strukturalnymi koronawirusów. Koronawirusy odpowiadają za infekcję górnych i dolnych dróg oddechowych u ludzi. Szacunkowo, około 1 - 10% populacji cierpi rocznie na przeziębienia (infekcje górnych dróg oddechowych) wywołane przez ludzkiego koronawirusa NL63 (HCoV NL63). Białko N jest głównym białkiem strukturalnym formującym nukleokapsyd HCoV NL63. Ponadto, białko N jest zaangażowane w inne procesy, w tym replikację wirusa oraz unikanie odpowiedzi układu immunologicznego. Podczas, gdy rola białka N w replikacji wirusa jest względnie dobrze poznana, dane na temat struktury białka N α-koronawirusów nie były znane na dzień rozpoczęcia badań. W pracy opisano struktury krystaliczne domen N- i C- (odpowiednio NTD, reszty 10-140 i CTD, reszty 221-340) białka N pochodzącego z α-koronawirusa HCoV NL63, obydwie z rozdzielczością 1.5 Å. W oparciu o strukturę NTD zaproponowano model wiązania RNA, a następnie zweryfikowano go eksperymentalnie. Struktura domeny C-terminalnej ukazała, że białko N w naturze występuje w formie dimeru. Badania te pozwoliły na lepszy wgląd w początkowe etapy interakcji białko N / kwas nukleinowy. Badania opublikowano w 2017 r. w czasopiśmie Journal of Virology, 91(11), e02503-16. Podsumowując, wyniki przedstawione w niniejszej pracy poszerzają podstawową wiedzę na temat fizjologii wirusów, w szczególności roli transglikozylazy P5 z bakteriofaga ф 6 oraz białka nukleokapsydu HCo NL63. W szerokiej perspektywie badania te mogą przyczynić się do opracowania metod kontroli patogenów roślinnych i koronawirusowych zakażeń ludzi.

This study focuses on the structural and functional characteristic of selected viral proteins. The described research relates to P5 transglycosylase from bacteriophage ф 6 and the nucleocapsid protein (N) of human α coronavirus NL63 (HCo NL63). Phage ф 6 infects Pseudomonas syringae, a Gram - negative bacterium, a pathogen of a number of crops. The P5 enzyme exhibits lytic activity against the cell wall of Gram - negative bacteria. P5 has been initially classified as a protease with potentially novel mechanism of catalysis. Later, however, suggestions appeared which indicated a possible mechanism of P5 action as a lytic transglycosylase. The aim of research described in this dissertation was to characterize the catalytic activity and the mechanism of action of P5 by combining biochemical and structural approaches. The crystal structure solved in this study is analogous to lysozyme and lytic transglycosylase structures suggesting that P5 exhibits one of the above activities and thus it probably is not a protease. Analysis of the substrate specificity using synthetic substrates and isolated bacterial cell wall allowed identification of products typical for lytic transglycosylases. Overall, this study demonstrated that P5 exhibits neither proteolytic or lysozyme activities, but rather is active as lytic transglycosylase. Site directed mutagenesis of key amino acid residues confirmed the above conclusion. Aside the catalytic domain, P5 contains atypical N- and C- terminal extensions. It is shown here that the N-terminal part as well as the C-terminal helix participate in regulation of P5 activity. The mechanism by which C-terminal helix regulates P5 activity is explained in detail by analysing the activity of a number o point mutants. My interest in the physiology of viruses has further prompted me to undertake studies on coronavirus structural proteins. Coronaviruses are responsible for upper and lower respiratory tract infections in humans. Annually, an estimated 1 - 10% of the population suffers from symptoms of common cold resulting from human coronavirus NL63 (HCoV NL63) infection. The N protein is a major structural protein which forms the nucleocapsid of HCoV NL63. In addition, N protein is involved in other processes, including viral replication and in avoiding the response of the immune system by the virus. While the role of N protein in viral replication is relatively well understood, structural data on N protein from α-coronavirus were non-existent at beginning of the study. The study reports crystal structures of the N- and C- domains (NTD, residues 10-140 and CTD, residues 221-340) of N protein derived from the α-coronavirus HCoV NL63, both with a resolution of 1.5 Å. Based on the NTD structure, an RNA binding model was proposed and verified experimentally. The structure of the C-terminal domain demonstrated that the N protein occurs in the form of a tight dimer likely preserved in nature. Overall, the studies described here have provided a better insight into the initial stages of N protein - nucleic acid interaction. The results of characteristic of N-protein of human coronavirus NL63 were published in 2017 in the journal Journal of Virology, 91 (11), e02503-16. In conclusion, the results presented in this study broaden our basic knowledge about the physiology of viruses, in particular the role of P5 transglycosylase from the phage ф 6 and the nucleocapsid protein of human coronavirus NL63. In a broad perspective, these studies can contribute to the development of methods for the control of plant pathogens and coronavirus human infections.