Expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) by macrophages upon stimulation by various lipopolysaccharide concentrations

Tlenek azotu (NO) pełni kluczową rolę w zapaleniu, jako czynnik cytotoksyczny uczestniczący w eliminacji patogenów. Powstawanie NO jest katalizowane przez indukowalną syntazę tlenku azotu iNOS (ang. inducible nitric oxide synthase). Ekspresja tego enzymu zachodzi pod wpływem stymulacji makrofagów cytokinami pro-zapalnymi lub lipopolisacharydem (LPS). W badaniach biomedycznych, makrofagi są najczęściej stymulowane LPS w stężeniach 1-10 μg/ml. Jednak okazuje się, że również bardzo niskie stężenia LPS (tzw. super-low-dose LPS) mogą aktywować te komórki do produkcji cytokin pro-zapalnych. Dlatego celem niniejszej pracy było zweryfikowanie ekspresji iNOS w makrofagach przez różne stężenia LPS, w tym bardzo niskie. W doświadczeniach użyto makrofagi z linii komórkowej RAW 264.7, które stymulowano 50 pg/ml, 1 μg/ml i 10 μg/ml LPS. Ekspresja iNOS została oznaczona techniką immunocytochemiczną. Analizę preparatów wykonano dwoma różnymi metodami poprzez oznaczenie liczby makrofagów iNOS+, oraz automatycznie za pomocą programu ImageJ. W tym drugim przypadku szacując procent powierzchni preparatu pokrytej przez komórki iNOS+. Stężenie 50 pg/ml LPS nie wzbudziło znaczącej ekspresji iNOS w makrofagach RAW 264.7, w przeciwieństwie do pozostałych stężeń. Zatem w przypadku tej mysiej linii komórkowej makrofagów bardzo niskie stężenie LPS nie wpływało na ekspresję enzymu odpowiedzialnego za produkcję NO. W przypadku dwojakiej analizy wyników immunocytochemicznych otrzymano częściową korelację pomiędzy zastosowanymi metodami, jednak metoda z ImageJ wymaga dalszego dopracowania. Podsumowując, w przypadku makrofagów RAW 264.7, bardzo niskie stężenie LPS nie wpływa na ekspresję iNOS. Wyniki te należy jednak zweryfikować na makrofagach pierwotnych, u których stężenie to wpływało na ekspresję cytokin.

Nitric oxide (NO) plays a key role in inflammation as a cytotoxic agent involved in the elimination of pathogens. The formation of NO is catalyzed by inducible nitric oxide synthase (iNOS). Expression of this enzyme occurs in macrophages upon stimulation with pro-inflammatory cytokines or lipopolysaccharide (LPS). In biomedical research, macrophages are most often stimulated with LPS at concentration of 1-10 μg/ml. However, very low LPS concentrations (so-called super-low-dose LPS) can also activate these cells to produce pro-inflammatory cytokines. Therefore, the aim of this study was to verify the iNOS expression in macrophages upon stimulation by various LPS concentrations, including very low ones. Macrophages from RAW 264.7 cell line were used in the experiments and they were stimulated with 50 pg/ml, 1 μg/ml and 10 μg/ml LPS. Expression of iNOS was assessed by immunocytochemistry. Analysis of the specimens was performed by two different methods, by determining the number of iNOS+ macrophages, and automatically, using the ImageJ program. In the latter case, estimating the percentage of the area covered by the iNOS+ cells. The concentration of 50 pg/ml LPS did not induce significant iNOS expression in RAW 264.7 macrophages, in contrary to the other concentrations. Thus, in the case of this murine macrophage cell line, super-low-dose of LPS did not affect the expression of the enzyme responsible for NO production. In the case of dual analyses of immunocytochemical results, a partial correlation was obtained between the methods used, however the ImageJ method requires further adjustment. To conclude, in the case of RAW 264.7 macrophages, very low LPS concentration does not affect the expression of iNOS. These results should be verified on primary macrophages in which the concentration affected the expression of cytokines.